HPLC法测定牡丹籽油中游离型和结合型α-亚麻酸、亚油酸及油酸的含量

罗国平，梁宇柱，闫梦茹，张存劳，孟会宁，吴环环，宋 静

(1.西安医学院 药学院，西安 710021； 2.西安中粮工程研究设计院有限公司，西安 710082； 3.山东步长医药销售有限公司，山东 菏泽 274418)

HPLC法测定牡丹籽油中游离型和结合型α-亚麻酸、亚油酸及油酸的含量

罗国平1，梁宇柱2，闫梦茹1，张存劳1，孟会宁3，吴环环1，宋 静1

(1.西安医学院 药学院，西安 710021； 2.西安中粮工程研究设计院有限公司，西安 710082； 3.山东步长医药销售有限公司，山东 菏泽 274418)

采用高效液相色谱(HPLC)法测定牡丹籽油中游离型、结合型α-亚麻酸、亚油酸及油酸的含量。检测条件为Agilent C18高效色谱柱(3.0 mm×50 mm， 2.7 μm)，流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液(体积比85∶15)，流速1 mL/min，检测波长203 nm，柱温35℃，进样量20 μL。结果表明，该方法精密度、重复性、稳定性良好。α-亚麻酸在41.4～207 μg/mL范围内，其峰面积与质量浓度呈良好的线性关系；亚油酸在20.2～101 μg/mL范围内，其峰面积与质量浓度呈良好的线性关系；油酸在14.9～74.6 μg/mL范围内，其峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。牡丹籽油样品中，游离型α-亚麻酸、亚油酸和油酸的平均含量分别为4.47、1.89 mg/mL和0.92 mg/mL，结合型α-亚麻酸、亚油酸和油酸的平均含量分别为437、237 mg/mL和156 mg/mL。建立的方法具有分离效率高、选择性好和条件温和的优点。

牡丹籽油；α-亚麻酸；亚油酸；油酸；高效液相色谱法

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科芍药属灌木，牡丹籽油因具有丰富的营养，又有医疗保健功效，被称为植物油中的珍品[1-2]。牡丹籽油中含有α-亚麻酸、亚油酸、油酸、维生素E等多种营养成分[3]。牡丹籽油中α-亚麻酸、亚油酸和油酸3种不饱和脂肪酸含量高低可作为评价牡丹籽油保健作用强弱的指标之一。

据查，牡丹籽油中脂肪酸有两种存在形式，游离型脂肪酸和结合型脂肪酸。前者的含量一般远远低于后者，但是牡丹籽油在储存过程会因储存条件不当或者储存时间过长导致部分脂肪酸由结合型分解为游离型。目前，脂肪酸多采用气相法进行定量分析，该方法存在一些不足：一是需将样品甲酯化[4-6]，影响因素多，容易导致反应不完全；二是在分析过程中由于柱温较高，易使亚油酸和α-亚麻酸的双键断裂或产生双键的异构化现象[7]；三是未将游离型脂肪酸和结合型脂肪酸加以区分。为此，笔者采用高效液相色谱(HPLC)法[8-10]，在相同色谱条件下，分别采用两种方法制备供试品溶液，第一种方法为取牡丹籽油加甲醇超声溶解，离心后取上清液进样，测定的是游离型脂肪酸的含量；第二种方法为牡丹籽油先碱水解、皂化，反应完全后酸化，用正己烷萃取，萃取液除去正己烷，最后用甲醇溶解后进样，测定的是游离型脂肪酸和结合型脂肪酸含量之和，减去第一种方法中测得的游离型脂肪酸含量，即可得到结合型脂肪酸的含量。该方法具有分离效率高、选择性好、条件温和的特点，可分别测定游离型脂肪酸和结合型脂肪酸的含量。目前，采用HPLC法测定牡丹籽油中脂肪酸含量的文献报道较少，鲜有采用此方法分别测定牡丹籽油中游离型、结合型的α-亚麻酸、亚油酸及油酸含量的研究报道，故本文所述方法具有一定的学术和实际意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

牡丹籽油，自制；α-亚麻酸(批号21967)、亚油酸(批号B21421)和油酸(批号B21592)对照品，购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪，安捷伦；UV-2012型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；KQ-5200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ALC-210.4型精密电子天平，赛多利斯。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 油酸、亚油酸和α-亚麻酸混合对照品溶液的制备

分别取α-亚麻酸对照品约100 mg、亚油酸对照品约50 mg、油酸对照品约37 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀后精密吸取混合液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(α-亚麻酸质量浓度为207 μg/mL，亚油酸质量浓度为101 μg/mL，油酸质量浓度为74.6 μg/mL)。

1.2.1.2 供试品溶液的配制

供试品溶液1：精密移取牡丹籽油125 μL，置25 mL容量瓶中，加甲醇23 mL，超声30 min，充分溶解，放冷后用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液2：精密移取牡丹籽油125 μL，置25 mL三口烧瓶中，加0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液4 mL，在60℃水浴中皂化20 min，待油珠溶解，放冷，转移至25 mL的分液漏斗中，加0.5 mol/L盐酸5 mL，加正己烷萃取3次，每次5 mL，合并萃取液，除去正己烷，残留物用甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，精密量取1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

以甲醇作为空白对照溶液。

1.2.2 色谱条件

Agilent C18高效色谱柱(3.0 mm×50 mm，2.7 μm)，流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液(体积比 85∶15)，流速1 mL/min，柱温35℃，检测波长203 nm，进样量20 μL。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 专属性试验

分别取上述混合对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

1.2.3.2 线性关系考察

精密量取1.2.1.1混合对照品溶液2.0、 4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制备成α-亚麻酸质量浓度分别为41.4、82.8、124、166、207 μg/mL，亚油酸质量浓度分别为20.2、40.4、60.6、80.8、101 μg/mL和油酸质量浓度分别为14.9、29.8、44.8、59.7、74.6 μg/mL的系列混合对照品溶液。精密吸取上述溶液20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以对照品质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，分别绘制标准曲线，进行线性回归。

1.2.3.3 精密度试验

取1.2.1.1混合对照品溶液连续进样6次，每次进样20 μL，测定峰面积，分别计算油酸、亚油酸和α-亚麻酸峰面积的RSD。

1.2.3.4 重复性试验

取牡丹籽油6份，照1.2.1.2供试品溶液2方法分别制备供试品溶液，进样测定峰面积，分别计算油酸、亚油酸和α-亚麻酸的平均含量和RSD。

1.2.3.5 稳定性试验

取同一份 1.2.1.2供试品溶液2方法制备的供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进行检测，分别计算油酸、亚油酸和α-亚麻酸峰面积的RSD。

1.2.3.6 加样回收试验

精密量取已知α-亚麻酸、亚油酸、油酸含量的牡丹籽油6份，其中3份按1.2.1.2供试品溶液1方法制备，另外3份按1.2.1.2供试品溶液2方法制备，分别精密加入与供试品溶液中3种脂肪酸含量80%、100%和120%的对照品，按本方法测定，分别计算加样回收率和RSD。

1.2.4 牡丹籽油中α-亚麻酸、亚油酸和油酸的含量测定

精密量取3份牡丹籽油，分别按照1.2.1.2方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL注入高效液相色谱仪，按本方法测定，记录峰面积，分别计算3种脂肪酸(游离型和结合型)的含量。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

虽然油酸、亚油酸、α-亚麻酸的分子结构中仅含有非共轭双键，但是在采用HPLC法测定脂肪酸含量时，很多文献还是选择了紫外检测器。在检测波长选择方面，有文献选择210 nm[11]，也有选择205 nm[12]，还有选择203 nm[13]；除此以外，还有文献报道采用制备脂肪酸衍生物后，在检测波长为242 nm处进行测定[14]。综合考虑并经预试验，本文选择检测波长为203 nm。

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性试验(见图1)

从图1可看出，供试品1和供试品2色谱图与混合对照品色谱图中3个待测组分对应的色谱峰的保留时间相同，色谱峰分离度好，且空白样品无干扰，说明本法专属性好。

2.2.2 线性关系考察

α-亚麻酸回归方程为y=22.217x+191.53，r=0.998 1，结果表明α-亚麻酸在41.4～207 μg/mL范围内，其峰面积与质量浓度线性关系良好。亚油酸回归方程为y=19.88x+42.821，r=0.998 6，结果表明亚油酸在20.2～101 μg/mL范围内，其峰面积与质量浓度线性关系良好。油酸回归方程为y=6.698 2x+20.998，r=0.999 3，结果表明油酸在14.9～74.6 μg/mL范围内，其峰面积与质量浓度线性关系良好。

2.2.3 精密度试验

α-亚麻酸、亚油酸和油酸峰面积的RSD分别为1.62%、1.25%和1.33%，说明检测仪器的精密度良好。

2.2.4 重复性试验

α-亚麻酸、亚油酸和油酸的平均含量分别为441、239 mg/mL和157 mg/mL，RSD分别为2.32%、1.68%和2.58%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验

α-亚麻酸、亚油酸和油酸峰面积的RSD分别为2.01%、1.76%和1.36%，表明供试品溶液中这3种成分在12 h内稳定性良好。

2.2.6 加样回收试验(见表1)

表1 加样回收试验结果

从表1可看出，游离型α-亚麻酸、亚油酸和油酸的平均加样回收率分别为95.57%、103.07%和102.00%，RSD分别为2.18%、7.06%和4.02%；结合型α-亚麻酸、亚油酸和油酸的平均加样回收率分别为94.87%、97.07%和94.40%，RSD分别为4.13%、1.87%和2.52%。

2.3 牡丹籽油中α-亚麻酸、亚油酸和油酸的含量(见表2)

表2 牡丹籽油中α-亚麻酸、亚油酸和油酸的含量 mg/mL

从表2可看出，牡丹籽油中，游离型α-亚麻酸、亚油酸、油酸的平均含量分别为4.47、1.89、0.92 mg/mL，结合型α-亚麻酸、亚油酸、油酸的平均含量分别为437、237、156 mg/mL。样品中3种脂肪酸结合型的含量远远大于游离型的含量(基本都相差100倍左右)，说明自制的牡丹籽油中脂肪酸主要以结合型存在。

3 结 论

本文采用高效液相色谱法测定牡丹籽油中游离型和结合型α-亚麻酸、亚油酸及油酸的含量，色谱柱为Agilent C18高效色谱柱(3.0 mm×50 mm，2.7 μm )，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(体积比85∶15)，流速1 mL/min，检测波长203 nm，柱温35℃，进样量20 μL。该方法具有分离效率高、选择性好、条件温和的特点，而且能分别测定游离型脂肪酸和结合型脂肪酸的含量，解决了现有技术中存在的一些不足，如样品前处理烦琐、反应不完全，柱温高导致脂肪酸双键异构化等，特别是为测定牡丹籽油在储存过程中3种功能性不饱和脂肪酸由结合型转变为游离型的含量变化提供了一个新方法。

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Determinationofcontentsoffreeandconjugatedα-linolenicacid,linoleicacidandoleicacidinPaeoniasuffruticosaAndr.seedoilbyHPLC

LUO Guoping1，LIANG Yuzhu2，YAN Mengru1，ZHANG Cunlao1， MENG Huining3，WU Huanhuan1，SONG Jing1

(1.College of Pharmacy, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China; 2. Xi’an COFCO Engineering Research & Design Institute Co., Ltd., Xi’an 710082, China; 3. Shandong Buchang Medicine Co., Ltd., Heze 274418, Shandong, China)

The contents of free and conjugatedα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid inPaeoniasuffruticosaAndr. seed oil were determined by HPLC. The detection conditions were as follows: Agilent C18 column (3.0 mm×50 mm, 2.7 μm), mobile phase acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (volume ratio 85∶15), flow rate 1 mL/min, detection wavelength 203 nm, column temperature 35℃ and injection volume 20 μL. The results showed that the method had good precision, repeatability and stability. Good linear relationships ofα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were achieved in the mass concentration ranges of 41.4-207 μg/mL, 20.2-101 μg/mL and 14.9-74.6 μg/mL, respectively. The average contents of freeα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were 4.47，1.89 mg/mL and 0.92 mg/mL respectively, and the average contents of conjugatedα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were 437，237 mg/mL and 156 mg/mL respectively inPaeoniasuffruticosaAndr.seed oil. The methods had the advantages of high separation efficiency, good selectivity and mild conditions.

PaeoniasuffruticosaAndr. seed oil;α-linolenic acid; linoleic acid; oleic acid; HPLC

2016-12-14；

：2017-04-17

2016年陕西省教育厅专项科研计划项目(16JK1650)；陕西省2014年省级大学生创新创业训练计划项目(1644)；西安医学院2015年大学生创新创业训练计划项目(2015DXS1-18)

罗国平(1979)，男，副教授，硕士，主要从事药物新制剂、新剂型和新技术的教学和科研工作(E-mail)36163297@qq.com。

TS227;Q547

：A

1003-7969(2017)08-0140-05

检测分析