炎症相关基因多态性与心脏瓣膜置换术后华法林疗效的相关性研究

陈冲 何勇

炎症相关基因多态性与心脏瓣膜置换术后华法林疗效的相关性研究

陈冲 何勇

作者单位：525200 广东省高州市，高州市人民医院胸心外科

目的 探讨炎性基因IL-17的多态现象与心脏瓣膜置换术后华法林疗效的关系。方法 纳入我院行心脏瓣膜置换术采用华法林治疗的患者96例作为观察组，另外纳入未采用华法林治疗的生物瓣置换术患者78例作为对照组。采用基因测序的方法确定单核苷酸多态性的等位基因，分析两组患者的基因型及临床特点，探讨分析心脏瓣膜置换术后华法林治疗与不同的IL-17基因型之间的关系；采用Logistic回归分析基因型与心脏瓣膜置换术后危险因素之间的相关性；运用Kaplan-Meier的生存曲线对携带IL-17 rs763780及rs2275913两种基因型患者的生存及疗效情况进行分析。结果 IL-17基因型在两组的基因型分布是不相同的。通过多因素的Logistic回归分析显示，rs763780（OR=2.998，95%CI 1.176～7.639，P=0.023）及rs2275913（OR=2.936，95%CI 1.198～7.246，P=0.019）两种基因型是心脏瓣膜置换术后并发症发生的危险因素；术后携带rs763780基因型者心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的风险增加16%，而携带rs2275913基因型者心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的风险增加28%。疗效及生存分析方面，携带rs2275913基因型IL-17高表达的患者生存时间为（37.34±10.90）个月，而低表达的患者生存时间为（54.23±12.43）个月，两组比较差异具有统计学意义，IL-17rs2275913基因型表达的高低与预后有着一定的相关性。结论 IL-17的G等位基因是心脏瓣膜置换术后并发症发生的危险因素；rs2275913基因型与心脏瓣膜置换治疗及预后有着相关性，可作为心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的危险因素。

心脏瓣膜置换术； 华法林； 白介素-17； rs2275913基因型； rs763780基因型； 基因多态性； 炎症相关

心脏瓣膜置换大大降低了心脏相关疾病的死亡率，但是预后仍不理想，多数患者治疗后仍会发生各类并发症，影响患者的预后。炎症相关性因子与心脏内膜疾病密切相关，越来越被关注[1,2]。验证相关基因IL-17是特异性降解细胞外基质和基底膜的主要因素，也是心脏内膜疾病最重要的因子，对心血管疾病的发生发展起着关键性作用，为此本研究对IL-17进行不断深入研究，以提高心脏瓣膜置换的水平[3,4]。已有研究提示，IL-17的G-197A位点上存在着基因多态性位点，该位点存在在种子序列当中，可以调控该基因的成熟体；且研究还提示，IL-17基因的上调与心脏瓣膜疾病有着密切的关系。华法林对心脏瓣膜置换术后的治疗具有重要的临床实践意义[5]。本研究初步探讨炎症相关基因IL-17多态性与心脏瓣膜置换术后华法林治疗效果的作用关系，为进一步探讨其与预后的关系奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 纳入2014年1月至2016年1月我院行心脏瓣膜置换术后采用华法林治疗的患者96例作为观察组，另外纳入未采用华法林治疗的生物瓣置换术患者78例作为对照组，年龄32～66（53.65±10.95）岁。在术中取材之后，血液标本报告为标准，提取两组患者的血液标本RNA，送华大基因研究院进行检测。对所有手术治疗的患者进行随访观察，随访时间每月1次。

1.2 试验试剂和仪器

1.2.1 试剂 Platinum SYBR Green qPCR Super－Mix-UDG（美国Invitroge公司），蛋白酶 K（默克生物公司），TaqMix（东盛生物公司），PCR试剂盒、TaqMan RNA试剂盒（美国Santa Cruz公司），RNA提取试剂盒（美国Sigma），DEPC（上海碧云天生物），乙醇、异丙醇、氯仿（上海硕盟生物）。

1.2.2 仪器 高速冷冻离心机（德国BiofugeS－tratos），-80℃～4℃冰箱（日本松下），PCR仪（澳大利亚 Rotor-gene），紫外分光光度仪（Beckman Coulter公司）。

1.3 RNA提取及qPCR检测 对纳入研究对象的血液标本采用RNA提取试剂盒进行RNA提取，采用TaqMan RNA试剂盒检测IL-17的相对表达量。采用RNU6作为内参进行校正。对IL-17的表达水平采用二步法进行检测，第一步通过茎环引物来合成互补DNA，再通过RNA的逆转录系统对10 ng RNA进行反应。PCR管加入10 μl的逆转录缓冲液，总的RNA浓度调整到2 ng/μl，最后加入 5 μl的逆转录引物，在冰上混匀之后反应5 min，接着进行梯度变性反应，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72℃、7 min递减；第二步采用 Platinum SYBR Green qPCR的反应体系，反应体系为2×的 PCR Taqman Universal的混合液及Taqman RNA的特异性引物，通过逆转录体系进行反应。cDNA共5 μl加入RNA的去酶水当中，将体积扩增至20 μl，通过循环反应94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min递减的扩张40个循环之后，对实验结果进行分析。采用荧光实时定量反应，按照PCR操作说明，Ct的检测值在20～32之外的需要进行第二次检测。应用△Ct=CtIL-17－CtRNU6的计算公式计算IL-17的相对表达量。

1.4 统计学方法 所有采集的数据应用SPSS 21.0统计软件建立数据文件。Pearson卡方判断对照组的基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，正态分布采用±s表示，组间比较用方差分析，组间均数比较采用t检验，组间率的比较用卡方检验。IL-17各个基因型的差异性表达采用方差分析，两组比较采用SNK-q检验。采用Logistic回归分析IL-17 rs2275913及 rs763780基因型是否为预后的危险因素。运用Kaplan-Meier的生存曲线对患者的生存情况进行分析，IL-17 rs763780基因型携带者与生存率之间的关系，统计检测采用双尾的检测方法，应用Mann-whitney U检验法进行两两数据之间比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床特征比较 两组基线资料比较，年龄相比未见统计学差异（P＞0.05），肝肾功能比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。基因型分布，观察组的rs2275913基因型所分布的比例明显高于对照组（P＜0.05），而rs763780基因型的分布比例两组比较未见统计学差异（P＞0.05）。临床资料显示对照组的各个基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.75）。见表1。

2.2 严重并发症发生人群基本特征 出现严重并发症的患者rs2275913基因型的比例要高于未出现严重并发症患者，提示IL-17的rs2275913基因型是心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的重要危险因素，年龄、肝肾功能损伤也是主要危险因素。见表2。

2.3 基因型与心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的危险因素 研究结果显示，rs2275913及rs763780两种基因型是心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的危险因素，其中携带rs763780基因型，OR=2.998，95%CI 1.176 ～7.639，P=0.023； 携 带rs2275913 基因型，OR=2.936，95%CI 1.198～7.246，P=0.019；携带rs763780基因型者心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的风险增加16%，而携带rs2275913基因型者心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的风险增加28%。从华法林的疗效看，治疗后携带rs763780基因型患者者严重并发症的风险降低，OR=2.936，95%CI 0.576～1.896，P=0.019；携带rs2275913基因型患者严重并发症风险降低，OR=1.846，95%CI 1.148～2.965，P=0.015，提示华法林可显著降低两基因型患者严重并发症的发生风险。见表3。

表1 两组患者临床特征比较（±s）

表1 两组患者临床特征比较（±s）

基因型分布＞50 ≤50 丙氨酸转氨酶（U/L） 天门冬氨酸转氨酶（U/L） 血肌酐（μmol/L） rs2275913 rs763780对照组 78 38 40 21.47±0.45 19.17±4.96 42.36±9.67 6 10观察组 96 46 50 106.45±72.37 99.86±60.31 169.74±35.65 45 28 t/χ2值 0.53 8.64 7.26 6.77 7.44 P值 0.76 0.00 0.00 0.00 0.00年龄（岁） 肝功能组别 例数

表2 心脏瓣膜置换术后肝功能与基因型分布特征比较（±s）

表2 心脏瓣膜置换术后肝功能与基因型分布特征比较（±s）

组别 例数 年龄（岁） 肝功能 基因型分布＞50 ≤50 丙氨酸转氨酶（U/L） 天门冬氨酸转氨酶（U/L） 血肌酐（μmol/L） rs2275913 rs763780非严重并发症组 66 39 27 48.45±17.66 68.16±12.33 69.37±14.67 18 12严重并发症组 20 16 4 146.75±70.65 156.87±80.34 287.44±135.66 10 7 t/χ2值 3.67 9.54 8.26 7.34 2.34 P值 0.01 0.00 0.00 0.00 0.03

表3 Logistic回归分析基因型与心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的危险因素分析

2.4 IL-17携带rs2275913基因型表达的高低与预之间的相关性 96例观察组患者IL-17的相对表达量为1.436，95%CI 0.323～0.534，表达量低于平均值的有42例，高于平均值的有54例。携带rs2275913基因型IL-17高表达的患者生存时间为（37.34±10.90）个月，而低表达的患者生存时间为（54.23±12.43）个月，两组比较差异具有统计学意义。IL-17携带rs2275913基因型的高低与预后有着一定的相关性。

3 讨论

心脏瓣膜置换大大降低了心脏疾病的病死率，但是术后一旦出现严重并发症，则预后极差，生存率较低[6]。华法林可以有效防止血栓的扩大，同时溶解血栓，起到消除症状、预防肺栓塞及血栓复发的作用，且不增加出血等不良反应的发生概率。随着生物信息学的发展，心脏瓣膜置换的预后相关研究越来越深入。研究发现基因参与疾病的发生发展，并与预后密切相关，其表达谱还决定病情的严重程度，在临床病理因素中发挥着重要作用，尤其对于术后的生存期及预后具有一定的相关性。研究提示，特异性的基因可以用于对心脏瓣膜置换术后预后的评估，其表达量与疾病的预后有着一定的相关性[7-9]。

已有研究表明，IL-17A/F基因多态性与多种炎症反应和自身免疫性疾病有关[10-13]。研究还提示，IL-17基因的上调与心脏炎症活动有着密切的关系，但特定区域的单核苷酸多态性（SNPs）可以使人更易罹患疾病[14-16]。已有研究提示，IL-17可以调控该基因的成熟体，在调节局部组织炎症反应过程中起着重要作用。但是有关IL-17多态性与心脏瓣膜置换术后严重并发症发生之间的关系尚未见报道[17]。本研究旨在进一步研究阐明IL-17中的一种多态现象与心脏瓣膜置换术后严重并发症发生发展及预后的关系，进一步了解IL-17基因多态性与心脏瓣膜置换术后严重并发症发生之间的关系。

通过纳入心脏瓣膜置换术后华法林治疗患者的病例样本，采用基因测序的方法确定单核苷酸多态性的等位基因，分析心脏瓣膜置换术后严重并发症的发生与不同IL-17基因型之间的关系。结果显示，IL-17基因型在心脏瓣膜置换术后华法林治疗组及对照组中的分布是不同的。多因素的Logistic回归分析显示，rs763780及rs2275913两种基因型是心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的危险因素，携带 rs763780 基因型，OR=2.998，95%CI 1.176～7.639，P=0.023； 携 带 rs2275913 基 因 型 ，OR=2.936，95%CI 1.198～7.246，P=0.019；携带 rs763780基因型者心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的风险将增加16%，而携带rs2275913基因型者心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的风险将增加28%。从华法林治疗的效果上看，携带rs763780基因型的治疗后可降低严重并发症的风险，OR=2.936，95%CI 0.576～1.896，P=0.019；携带 rs2275913 基因型降低严重并发症风险，OR=1.846，95%CI 1.148～2.965，P=0.015。华法林治疗之后可显著降低两基因型患者的严重并发症发生风险。提示出现严重并发症的患者rs2275913基因型的比例要高于未出现严重并发症患者，IL-17的rs2275913基因型是心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的重要危险因素，而年龄、肝肾功能损伤也是心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的主要危险因素。携带rs2275913基因型、老龄、肝肾功能损伤患者心脏瓣膜置换术后严重并发症发生风险会明显增加。生存分析方面，携带rs2275913基因型IL-17高表达的患者生存时间为（37.34±10.90）个月，而低表达的患者生存时间为（54.23±12.43）个月，携带 IL-17rs2275913 基因型患者的生存时间要短于携带rs763780基因型，提示IL-17rs2275913基因型表达的高低与预后有着一定的相关性。

综上所述，我们发现基因的多态性在心脏瓣膜置换的调控机制上具有重要的作用，与术后并发症的发病、机制的调节及疾病的预后有着密切的关性。本研究结果提示，IL-17 rs2275913基因型可能与心脏瓣膜置换术后严重并发症及预后有关，该差异性表达推测可能是心脏瓣膜置换术后严重并发症发生早期的潜在靶点。但是本研究尚存在一定的不足。本研究病例数还相对较少，还未行长期的预后随访研究。接下来我们将进一步行前瞻性的队列研究以获得更多的相关资料。但是本研究初步揭示了IL-17基因多态性与心脏瓣膜置换术后严重并发症发生之间的相关性，综合之前的研究提示rs2275913基因型对心脏瓣膜置换术后严重并发症发生的影响可能是通过上调IL-17的表达，从而启动心脏瓣膜置换术后严重并发症发生发展。随着进一步的研究，我们相信更多的炎症相关基因调控机制将会得到揭示，从而为心脏瓣膜置换治疗及预后的判断提供新的方法及依据。

［1］Khor B，Gardet A，Xavier RJ.Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease.Nature，2011，474：307-317.

［2］Shih DQ，Targan SR.Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease.World J Gastroenterol，2008，14：390-400.

［3］Liu ZJ，Yadav PK，Su JL，et al.Potential role of Th17 cells in the pathogenesis of inflammatory bowel disease.World J Gastroenterol，2009，15：5784-5788.

［4］Asarch A，Barak O，Loo DS，et al.Th17 cells：a new therapeutic target in infl ammatory dermatoses.J Dermatolog Treat，2008，19：318-326.

［5］Hundorfean G，Neurath MF，Mudter J.Functional relevance of T helper 17（Th17）cells and the IL-17 cytokine family in inflammatory bowel disease.Inflamm Bowel Dis，2012，18：180-186.

［6］Kobayashi T，Okamoto S，Hisamatsu T，et al.IL23 differentially regulates the Th1/Th17 balance in ulcerative colitis and Crohn′s disease.Gut，2008，57：1682-1689.

［7］Lees CW，Barrett JC，Parkes M，et al.New IBD genetics：common pathways with other diseases.Gut，2011，60：1739-1753.

［8］Abraham C，Cho J.Interleukin-23/Th17 pathways and inflammatory bowel disease.Inflamm Bowel Dis，2009，15：1090-1100.

［9］Zhang Z，Hinrichs DJ，Lu H，et al.After interleukin-12p40，are interleukin-23 and interleukin-17 the next therapeutic targets forinflammatoryboweldisease?IntImmunopharmacol，2007，7：409-416.

［10］Pappu R，Ramirez-Carrozzi V，Ota N，et al.The IL-17 family cytokines in immunity and disease.J Clin Immunol，2010，30：185-195.

［11］Hot A，Miossec P.Effects of interleukin（IL）-17A and IL-17F in human rheumatoid arthritis synoviocytes.Ann Rheum Dis，2011，70：727-732.

［12］王红娟，刘瑜，杨洁，等.药物基因组学方程对中国患者低强度华法林抗凝治疗剂量的预测效果分析.中华老年多器官疾病杂志，2012，11：584-587.

［13］Iwakura Y，Ishigame H，Saijo S，et al.Functional specialization of interleukin-17 family members.Immunity，2011，34：149-162.

［14］王芳芳，郭心灵，李菲菲，等.基于华法林药物基因组学的临床用药模型建立.分子诊断与治疗杂志，2012，4：89-94.

［15］Liang SC，Long AJ，Bennett F，et al.An IL-17F/A heterodimer protein is produced by mouse Th17 cells and induces airway neutrophil recruitment.J Immunol，2007，179：7791-7799.

［16］Iwakura Y，Nakae S，Saijo S，et al.The roles of IL-17A in inflammatory immune responses and host defense against pathogens.Immunol Rev，2008，226：57-79.

［17］Paradowska-Gorycka A，Wojtecka-Lukasik E，Trefler J，et al.Association between IL-17F gene polymorphisms and susceptibility to and severity of rheumatoid arthritis（RA）.Scand J Immunol，2010，72：134-141.

Association of inflammation-associated gene polymorphism with Warfarin therapy after cardiac valve replacement

CHEN Chong，HE Yong.Thoracic Surgery，Gaozhou People′s Hospital，Gaozhou 525200，China

Objective To elucidate the relationship between polymorphism of inflammatory gene IL-17 and Warfarin therapy after heart valve replacement.Methods A total of 96 patients were enrolled in this study，and 78 patients who underwent heart valve replacement without warfarin were included in the study.Genomic sequencing.Ninety-six patients who underwent cardiac valve replacement were treated with warfarin as the observation group，and 78 patients who were not treated with warfarin were included as control group.Gene sequencing method was used to determine the content of single nucleoside The polymorphisms of IL-17 and IL-17 were analyzed by using logistic regression analysis.Results The genotype distribution of IL-17 genotype in two groups was different.Logistic regression analysis showed that rs763780 （OR=2.998，95%CI 1.176-7.639，P=0.023）and rs2275913（OR=2.936，95%CI 1.198-7.246，P=0.019）were the risk factors for postoperative complications of heart valve replacement.Patients with rs763780 genotype had an increased risk of serious complications after cardiac valve replacement.While those with rs2275913 genotype had a 28%greater risk of serious complications after heart valve replacement（37.34±10.90）months in the patients with high expression of rs2275913 genotype IL-17 and（54.23±12.43）months in the patients with low expression（P＜0.05）.There were significant differences between the two groups in the survival and survival time The expression of IL-17 rs2275913 genotype had a certain correlation with the prognosis.Conclusion Gallele of IL-17 is a risk factor for postoperative complications of heart valve replacement.The rs2275913 genotype is associated with heart valve replacement and prognosis，and may be a risk factor for heart valve replacement.

Cardiac valve replacement； Warfarin； Interleukin-17； rs2275913 genotype； rs763780 genotype； Gene polymorphism； Inflammation-related

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.09.017

R654.2

A

1672-5301（2017）09-0832-05

2016-10-12）