毕节市七星关区臭豆腐质量检测

聂 红，杨 姗

(1.贵州省毕节十中，贵州 毕节 551700；2.贵州工程应用技术学院，贵州 毕节 551700)

毕节市七星关区臭豆腐质量检测

聂 红1，杨 姗2*

(1.贵州省毕节十中，贵州 毕节 551700；2.贵州工程应用技术学院，贵州 毕节 551700)

选取贵州毕节市区毛霉长约1 cm的臭豆腐，利用平板法从臭豆腐菌落中分离、纯化得到优良毛霉菌落。利用正交分析，对毛霉产蛋白酶的液体发酵条件进行研究发现，在培养温度51 ℃、培养基pH值7.3、培养时间50h条件下，是毛霉产蛋白酶的活性最高，有利于快速水解蛋白质。

分离纯化；发酵；正交试验；毛霉产蛋白酶

毛霉产蛋白酶是蛋白酶中的一种，蛋白酶是作用于蛋白质、催化肽键水解的一类酶，是工业酶种中用得最多的一种酶，约占酶总量的60%，广泛应用于医药、食品、日用化工、制革等诸多行业，因此一直是国内外学者研究的重要课题。蛋白酶的种类很多，分类方式也很复杂。与动 、植物来源的蛋白酶相比，微生物来源的蛋白酶—微生物蛋白酶，因其具有培养简便、产量丰富，适于大规模工业化生产的特点而被广泛应用，同时菌种筛选、纯化、诱变乃至重组工程菌种技术的应用发展为其大规模工业化生产提供了坚实的基础，目前微生物蛋白酶已经被人们广泛应用于食品生产业，它在食品工业方面的潜力无可估量，是国内外科研中的一项热门领域。

利用微生物产生蛋白酶生产腐乳类食品，在我国已经有一千多年的历史[1]，腐乳是人们喜爱的一种传统大豆发酵食品，具有独特的风味，蛋白质含量极其丰富，且不含胆固醇，是一种质构颇似软干酪的植物蛋白食品[2]。在贵州，毕节大方的臭豆腐更是微生物蛋白酶应用于食品的一大杰作，被誉为贵州的十大小吃之一。与其他地方的腐乳类食品相比，其质地酥嫩细腻，食之清爽适口，佐以辣椒、花椒、盐末等调料，味道更为鲜美，其内并富含蛋白质、脂肪、糖、钙、铁以及维生素等有益成分，可谓是腐乳类食品中的极品，之所以其味道独特、营养丰富，毛霉蛋白酶对臭豆腐风味的形成起着至关重要的作用。之前人们不断对毕节市区臭豆腐的生产进行揣摩与研究。但目前，毕节市区豆腐乳类食品的研究仅限于宏观上(如温度、水分、发酵时间对成品的影响等)的分析，而对于其毛霉蛋白酶优良菌株的选育及发酵条件优化少有研究。

本文对贵州毕节市区臭豆腐中的毛霉进行分离、筛选，降低生产成本、提高产品品质具有重要意义。有利于推动食品发展及推广本地毕节的特产。通过研究，对于进一步丰富毛霉蛋白酶数据库具有理论意义，也对工业上加强新型酶制剂品种的开发和提高酶制剂的发酵水平有现实意义。

1 实验内容与方法

1.1 菌种培养基的制备

马铃薯蔗糖培养基：马铃薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，水1000 mL。配制方法如下：将马铃薯去皮，切成约2 cm2的小块，放入1500 mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻璃棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，再补足水至1000 mL，自然pH。

1.2 毛霉的分离与纯化

无菌条件下，将灭菌后的培养基倒于若干培养皿内摇匀放好，待凝固后，取2～3个将少许菌悬液滴于培养基上，用接种针画线使其分散，倒置培养皿将其放入30℃恒温培养箱中培养48～72 h，从长有单菌落的平板中选取典型的毛霉菌落，取孢子体制成菌悬液，再平板培养，镜检，重复培养2～3次以分离纯化毛霉。将纯化了的毛霉转接到察氏斜面上培养，待生长完好后置于4℃冰箱中保存。

1.3 菌悬液的制备

察氏培养基：蔗糖29.9926 g，NaNO32.0039 g，K2HPO41.0940g，MgSO4·7H20 0.5027g，KCl 0.5058g，FeSO4·7H2O 0.0098 g，水 1000 mL，pH值7.0～7.2。

于灭菌后的三角瓶中加入无菌水100 mL，放入一定量的细玻璃珠，经高压蒸汽锅内灭菌15min后，在净化工作台内，用接种针在臭豆腐上挑取菌丝放入三角瓶中，振荡10min后备用。(临用前配制)

1.4 不同pH值酪素溶液的配制

称取六组均为0.5 g的酪素于小烧杯中，各加入3滴0.1 mol/L的NaOH溶液，并用玻璃棒碾溶，大约10min后加入对应的pH溶液15 mL浸泡半小时，在40 ℃水浴中加热搅拌至完全溶解后定容到50 mL容量瓶中，并分别编号为L7.3、L7.4、L7.5和L7.25、L7.30、L7.35备用。

1.5 发酵培养基的制备

取六支250 mL灭菌的三角瓶，分别贴上标签为50℃、pH值7.3、48 h，50℃、pH值7.4、50 h，50℃、pH值7.5、52h，另外三个分别贴上对应的空白标签，然后都加入100 mL的蒸馏水，用缓冲液调成对应的pH值，加入等量洗净、煮过的白豆腐块，灭菌备用。

1.6 毛霉产蛋白酶的发酵条件优化

采用液体发酵培养基，以温度、培养基pH值、培养时间等因素进行(L933)正交实验，通过测定蛋白酶活力确定优化的发酵条件。将该毛霉产蛋白酶的最佳作用条件51℃、pH值7.4[5]作为参考，分别在51℃、pH值7.4附近，温度间隔1℃，pH值间隔0.1设定为50℃，51℃，52℃和pH值7.3，pH值7.4，pH值7.5三个点作正交实验，为了便于分析，添加作用时间为辅助因素，分别为48 h，50 h，52 h。利用正交设计软件对测量结果进行分析，得出温度、pH、时间共同作用时的最佳发酵条件。

在无菌条件下，除空白样，用接种针挑选1.2保存的优良毛霉菌落，均等量接入三角瓶内，在恒温振荡培养箱里，50℃培养各自对应的时间。待达到培养时间时，依次拿出，用离心机8800 r/min离心分离。在贴上对应标签的试管中，均加入2mL离心液，再各加2 mL对应pH值的酪素溶液，摇匀，放入40℃水浴锅中反应10min，立即加入加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸终止反应，摇匀静置10min，过滤，取1 mL滤液到新帖对应标签的试管中，分别加入5 mL 0.4 mol/L碳酸钠，1 mL 1∶1稀释的福林酚试剂，摇匀，在此恒温锅中恒温显色20min，测其吸光度并计算相对酶活力。

同理，在恒温振荡培养箱里，根据正交试验进行液体发酵，得出该蛋白酶最佳作用条件。

1.7 酶活力的计算

蛋白酶活力的测定：蛋白酶活力测定采用福林酚法[5]。并定义：在一定温度、适当pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需的酶量为一个蛋白酶活力单位。

蛋白酶活力=A×6×N/10

其中：A—吸光度对照标准曲线得出的酪氨酸释放量(即标准曲线回归方程中的y值)；6：反应液实际体积6 mL；10—反应时间10min；N—酶液稀释倍数(N=10)。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

配制0、10、20、30、40、50μg/mL的酪氨酸溶液，分别吸取1mL(平行样3次)在碱性条件下与1 mL 1∶1稀释的福林酚试剂置于40℃水浴显色20min，在680 nm处测定吸光度，数据如表1[3-4]。

表1 酪氨酸标准曲线Table 1 Tyrosine standard curve

用吸光度平均值作横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标，绘制标准曲线见图1。

图1 酪氨酸标准曲线Fig.1 Tyrosine standard curve

由图1可得回归方程为：y=158.84x(R2 =0.9976)

注：R2为相关系数方程值[6]，由作图获得；R2值越接近于1，说明实验数据能密集在求得的直线旁，用线性函数进行回归比较合理，即线性关系较好。本实验所得标准曲线线性关系较好，可以进行下一步实验。

2.2 毛霉产蛋白酶的发酵条件优化

根据实验方法1.7，采用正交试验考查温度、pH值、时间对毛霉产蛋白酶的相对活力的影响，结果见表2。

对表2中的数据用正交设计助手IIV3.1破解版软件进行处理，得到直观分析见表3。

表2 酶的最佳作用条件正交设计试验验与结果 2Table 2 The orthogonal experiment for the best conditions of the protease 2

表3 正交试验直观分析表Table 3 The analysis of the orthogonal test

由表3作图得到图2。

图2 温度、pH值、时间对毛霉蛋白酶的直观分析图Fig.2 The intuitive analysis diagram of temperature and pH and time on the mucor protease

从图2看出RT>RpH，即温度对该毛霉蛋白酶的影响最大；在温度51 ℃、pH值7.3、时间50h时为酶的最佳发酵条件。因此，我们在臭豆腐生产中应严格注意温度的控制。

3 结论

利用平板分离法，从臭豆腐的菌落中分离、纯化出优良的毛霉菌种，采用(L934)正交试验法对发酵条件进行研究，确定所分离的毛霉最佳发酵条件是温度是51 ℃、pH值7.3、时间50 h。

根据毕节市及大方县水体系pH值进行分析，显示出大方县水体系pH值略高于7.0，弱碱性，而毕节市水体系pH值高于8.0，偏碱性。由此说明，在臭豆腐的风味及口感的形成上，大方县弱碱性的水环境更有利于毛霉蛋白酶的水解，而毕节市偏碱性的水环境阻碍了毛霉蛋白酶的正常水解，使得所生产出的臭豆腐的风味受到影响，这可能是大方臭豆腐口感优化于毕节市臭豆腐的原因之一。因此，若要改善毕节市臭豆腐的生产，则需严格控制其水环境的pH处于中性，温度在51 ℃左右，以发挥毛霉蛋白酶的正常酶促水解作用。

[1] 赵雪松. 豆腐乳的一般制法[J].食品科学,1984(7): 59 - 61.

[2] 符晓静.孙君社.微生物蛋白酶在腐乳生产中的应用研究进展[J].食品科学,2005(26):122-124.

[3] 林登峰,李德发,陆文清.福林显色法测定饲料用蛋白酶活力的要点分析[J].检测技术,2003(4): 29-30.

[4] 颜骏程.毕节市区臭豆腐中毛霉蛋白酶性质的研究[D].毕节:毕节学院,2010.

[5] 邵 伟,邹 雪.毛霉3039产蛋白酶特性研究[J].中国调味品,2009(1): 62-63.

[6] 邓方席,刘素纯.腐乳毛霉菌种选育及产酶条件的研究[J].湖南农学院学报,1995(2):56- 60.

(本文文献格式：聂 红，杨 姗.毕节市七星关区臭豆腐质量检测[J].山东化工,2017,46(15):18-20.)

The Quality Testing About of the Stinky Tofu in Bijie City

NieHong1,YangShan2*

(1.The tenth Middle School of Bijie City,Guizhou Province,Bijie 551700,China;2.Chemical Engineering College,Guizhou University of Engineering Science,Bijie 551700,China)

The crude protease,produced by Mucor sp.,was extracted from strong-smelling preserved Stinky Tofu,whose length was over than 1 cm in Bijie City. The strong-smelling preserved bean curd were isolated and purified gain excellent mucor colony by platemethod. By orthogonal analyse,on mucor protease produced by liquid fermentation were studied,the Mucor protease maximum activity of conditions is temperature of 51 ℃,pH 7.30 and culture time 50h,facilitates the rapid hydrolysis of protease.

isolation purified;fermentation;orthogonal experiment;mucor protease

2016-05-19

贵州省科技厅、毕节市科技局、贵州工程应用技术学院联合基金项目(黔科合LH字[2015]7598)；贵州省化学工程与技术重点支持学科，贵州省煤化工工程协同创新中心

聂 红(1980—)，女，贵州毕节人，中学一级，主要从事分析检测工作；通讯作者：杨 姗(1982—)，女，彝族，硕士，副教授，贵州大方县人，研究方向：环境微生物、蛋白质。

TQ925+.2

A

1008-021X(2017)15-0018-03