双歧杆菌应用于早产新生大鼠安全性的研究*

杨国朋 朱明哲 劳成军 王芳芳

(1.滨州医学院，山东 烟台 264000； 2.滨州医学院烟台附属医院，山东 烟台 264000)

双歧杆菌应用于早产新生大鼠安全性的研究*

杨国朋1朱明哲2劳成军1王芳芳1

(1.滨州医学院，山东 烟台 264000； 2.滨州医学院烟台附属医院，山东 烟台 264000)

目的 研究双歧杆菌在早产新生大鼠中应用安全性的研究，以指导双歧杆菌在早产新生儿中的应用。方法 选取不同窝别的早产新生大鼠(母鼠怀孕第19日行剖宫产)30只，称取新生大鼠出生时的体重并记录。将所有新生鼠平均分为A、B、C三组，每组10只；A组(空白对照组)，给予惠氏金装奶粉喂养的同时给予生理盐水灌胃。B组(4 mg/g组)组给予惠氏金装奶粉喂养同时给予4 mg/g酪酸梭菌双联活菌散灌胃(主要有效成分为双歧杆菌)，C(8 mg/g组)组给予惠氏金装奶粉喂养同时给予8 mg/g酪酸梭菌双联活菌散灌胃。连续喂养3天，第4天禁食1天，第5天称取体重并记录后断头取血，ELSA法检测血液中TNF-α的含量，同时解剖新生大鼠的小肠，并做石蜡切片、HE染色并观察。结果 三组新生大鼠体重的变化为：A：(1.22±0.10)g，B：(1.15±0.10)g,C：(1.19±0.11)g，体重变化没有统计学差异。TNF-α含量为：A：(248.95±9.26) pg/ml,B：(243.20±24.97) pg/ml, C：(236.53±23.38)pg/ml,三组之间没有统计学差异。肠道石蜡切片显示部分新生大鼠出现轻微的新生儿坏死性小肠结肠炎的改变，三组之间新生儿坏死性小肠结肠炎的评分没有统计学差异。结论 给予双歧杆菌灌胃的早产新生大鼠并未出现与空白对照有统计学差异的变化。

双歧杆菌；早产；新生大鼠；安全性

双歧杆菌被认为是人类和其他温血动物包括反刍动物肠道中的关键微生物属，也是众所周知的一种肠道益生菌。目前双歧杆菌已经广泛应用于食品、保健和医疗等领域。很多研究报道了双歧杆菌对新生儿消化系统疾病的益处，比如：新生儿坏死性小肠结肠炎、抗生素相关性腹泻、炎性肠病等[1]。但仍有学者表示，由于益生菌对肠道保护作用的具体分子机制尚不明确，并且人为的引入外源菌类，有可能破坏肠道固有的菌群平衡[2]，如果出现菌群移位，存在引起肠道感染的风险，尤其是在消化系统发育不完善的早产新生儿[3-5]。本次试验以早产儿新生大鼠模型为对象[6]，研究双歧杆菌在早产新生大鼠中是否存在潜在的危害。

1 实验材料和方法

1.1实验动物以及分组

19日胎龄剖宫产的新生SD大鼠30只，雌雄不限，均购买自济南朋悦实验动物繁育有限公司。随机将其分为3组：A：空白对照组，自出生之日给予惠氏金装奶粉灌胃，同时给予生理盐水灌胃。B：4 mg/g组，自出生之日给予惠氏金装奶粉灌胃，同时给予4 mg/g的酪酸梭菌双联活菌散灌胃。C：8 mg/g组，自出生之日给予惠氏金装奶粉灌胃，同时给予8 mg/g的酪酸梭菌双联活菌散灌胃。分组给予编号并分别称取新生鼠的体重并记录。

1.2主要试剂和仪器

鼠笼(可自动喂水及饲料)，自制新生鼠保育箱，1.9F硅胶管(北京哲成科技有限公司)，1 ml注射器(圣光医用制品有限公司)；惠氏金装奶粉，灭菌生理盐水(山东齐都药业有限公司)，蒸馏水(滨州医学院实验室自制)，酪酸梭菌二联活菌散(山东科兴生物制品有限公司),ELSA试剂盒(上海金穗生物科技有限公司)，-80 ℃冰箱(海尔牌)，酶标仪(infinite M200)等。

1.3方法

自出生之日连续给予相应处理4天，各组新生鼠于第5天开始空腹24 h，第6日8点分别称取体重并记录。记录体重后，按A、B、C组的顺序断头处死，取血后检测TNF-α的含量[7-8]；自下腹部横行打开腹腔，右侧腹部找到回盲部，取出十二指肠至回盲部的肠管。观察取出的肠管。

取回盲部近端肠管1 cm左右分别固定于4%的多聚甲醛中24 h，石蜡包埋后做5 μm连续切片，常规HE染色并观察。

计算出新生鼠体重的差值，用SPSS18.0统计软件处理体重的差值和TNF-α的含量的数值，分析三组之间的差别并做出相应的三线图。

2 结 果

2.1各组体重变化

A、B、C组中新生小鼠均出现体重增长，各组之间体重的变化值无统计学差异。见表1。

表1 不同组间新生鼠体重变化

注：F=2.0，P=0.16

2.2各组间炎症因子TNF-α的变化

A、B、C组中TNF-α的含量无统计学差异。见表2：

表2 不同组间新生鼠炎症因子TNF-α的比较

注：F=0.41，P=0.67

2.3A组有2只大鼠肠管呈现黑红色，出现肠壁积气，为典型的新生大鼠坏死性小肠结肠炎的外观改变[9]，B、C两组分别出现1只新生大鼠坏死性小肠结肠炎肠管改变，其余新生大鼠的肠道均呈现出轻微的炎性改变，肠管整体呈现出黄红色的炎性改变。三组之间的差别不明显。见图1。

图1 A、B、C三组早产新生鼠的肠管石蜡切片

3 讨 论

双歧杆菌被是众所周知的一种肠道益生菌。目前双歧杆菌已经广泛应用于食品、保健和医疗等领域。在很多国家，双歧杆菌是配方奶及益生菌制剂中使用最广泛的一种益生菌[10]，很多研究报道了双歧杆菌对新生儿消化系统疾病的益处，比如：新生儿坏死性小肠结肠炎、抗生素相关性腹泻、炎性肠病等的预防和治疗。然而也有研究报道指出：双歧杆菌有可能存在潜在的危害，尤其是在消化系统发育不完善的早产新生儿。双歧杆菌是否可以用于早产的新生儿没有明确的指南。本次研究采用对照实验的方法，用早产的新生大鼠作为模型，实验结果显示给予双歧杆菌灌胃的早产新生大鼠并未出现与空白对照有统计学差异的变化。

本次试验显示，双歧杆菌用于早产新生大鼠并未表现出明显的不良反应。动物试验有其自身的局限性，不能说明双歧杆菌用于人类早产儿是安全的，仅能为临床提供一定的依据。双歧杆菌用于早产儿的安全性还需更多的基础实验和临床统计来证明。本次试验中，没有特殊的处理，存活的早产新生大鼠中出现了典型的新生儿坏死性小肠结肠炎的改变，这说明人工喂养和早产可能是新生儿坏死性小肠结肠炎的原因或者诱因，运用剖宫产的方式获取早产新生大鼠，可能更容易制作新生儿坏死性小肠结肠炎大鼠模型。已经有很多报道表明双歧杆菌对新生大鼠的消化道具有保护作用[11-13]，本次试验没有表现出双歧杆菌对新生儿消化系统的保护作用，这可能是因为双歧杆菌在早产新生儿中的保护作用本来就微弱，故没有出现统计学差异，也可能是因为双歧杆菌的剂量不够。有关益生菌对人体的作用尤其是对早产新生儿的作用，还需要更多的基础实验和临床研究来证明。

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[11] 向玲,杜维霞,刘依枫,等.双歧杆菌通过Zonulin影响坏死性小肠结肠炎新生大鼠模型肠道通透性[J]. 第三军医大学学报,2016,05:469-475.

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The security research of bifidobacterium applied to premature newborn rats

YANG Guo-peng1ZHU Ming-zhe2LAO Cheng-jun1WANG Fang-fang1

(1.Binzhou Medical University,Yantai 264000,China；2.Affiliated Hospital in Yantai Medical University,Yantai 264000,China)

Objective:To study the safety of bifidobacteria in premature newborn rats, and to guide the application of bifidobacteria in preterm newborns Methods:Thirty premature newborn rats from different mothers(uterine operation carried out on their mothers in the 19th day of pregnancy.)were selelcted. The birth weight of the newborn rats was recorded. The rats were put into Group A, B and C with 10 newborn rats. Group A were given lavage with wyeth gold powder and physiological saline for comparison. Group B(4mg/g group)were givn lavage with double wyeth gold powder and butyric acid bacteria living bacterium(Its main effective components was bifidobacterium)with the dose of 4mg/g. Group C(8mg/g group)were given lavage with double wyeth gold powder and butyric acid bacteria living bacterium(Its main effective components was bifidobacterium)with the dose of 8mg/g. The feed was given for three consecutive days. The fourth day was on fast. Blood was taken by beheading after they were weighed and recorded on the fifth day. The contents of TNF-ɑ in the blood were detected by ELISA method. The intestinal tubes of the neonatal rats were dissected, and the paraffin section and HE staining section were made and observed. Results: The changes of the weights of the newborn rats in the three groups were A:(1.22±0.10)g,B：(1.15±0.10)g,C：(1.19±0.11)g, and there was no statistically significant change in their weights. The contents of TNF-ɑ were A:(248.95±9.26)pg/ml, B：(243.20±24.97)pg/ml and C：(236.53±23.38)pg/ml. There was no statistical difference among the three groups. The paraffin section showed the partial change of neonatal necrotizing enterocolitis and there was no statistical difference in the scores of neonatal necrotizing enterocolitis among the three groups. Conclusion: Preterm fresh neonatal rats fed with Bifidobacterium do not show a significant difference from the control control.

bifidobacterium; premature; newborn rats; security

杨国朋(1988—)，男，山东滨州人，研究生。

朱明哲，副主任医师，E-mail:13156919099@163.com。

R37

：A

：1004-7115(2017)09-01003-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.09.014

2017-06-23)