食物因素对桔小实蝇表皮碳氢化合物的影响

雷妍圆，林 涛，何丽云，吕利华*，何余容，李群臣

(1. 广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；2. 华南农业大学农学院，广州 510642；3. 广东省农业科学院，农业生物基因研究中心，广州 510640)

食物因素对桔小实蝇表皮碳氢化合物的影响

雷妍圆1，林 涛2，何丽云3，吕利华1*，何余容2，李群臣1

(1. 广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；2. 华南农业大学农学院，广州 510642；3. 广东省农业科学院，农业生物基因研究中心，广州 510640)

桔小实蝇Bactroceradorsalis是为害园艺作物的重要检疫性害虫。本研究采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，分析了取食3种寄主植物杨桃、番石榴和芒果的桔小实蝇雄成虫表皮碳氢化合物组成和含量，并以人工饲料饲养作为对照进行了比较。结果表明，4种食物源的桔小实蝇共含有42种表皮碳氢化合物，其碳原子数为C29-C37，主要为正构烷烃、一甲基烷烃和二甲基烷烃。取食杨桃、番石榴和芒果桔小实蝇表皮碳氢化合物种类分别为人工饲料的99.3%、91.4%和98.3%，4种食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物种类基本相同，主成分分析和判别分析可从含量上将各食物源的桔小实蝇区分开。不同食物源引起的差异体现在物质的含量上，而主要的组分种类相对稳定，说明食物因素不影响利用表皮碳氢化合物进行桔小实蝇种的鉴定。因此可提取种内共有物质作为种的特征峰，建立不同食物条件下桔小实蝇的指纹图谱，为检验检疫过程中实蝇种类的鉴定提供数据支持。

桔小实蝇；气相色谱分析；表皮碳氢化合物；食物因素；雄成虫

实蝇类昆虫繁殖力强，危害隐蔽且严重，在世界范围内严重威胁水果生产安全，造成重大的经济损失，是一类危险的入侵昆虫。其一旦传入适宜的生存环境，就有暴发成灾的可能，被许多国家列为重要检疫性害虫(梁帆等，2001；Stephensetal.，2007；丁吉同等，2014)。近年来，随着中国与世界贸易的日益频繁，进境水果和蔬菜中截获的实蝇数量和批次大幅上升，桔小实蝇BactroceradorsalisHendel成为国内为害果蔬的重要优势种(高媛惠等，2016)。

桔小实蝇寄主范围广，可危害柑橘、杨桃、芒果、香蕉、荔枝、瓜类等250多种水果和蔬菜(Clarkeetal., 2005)，以成虫产卵于寄主植物果实内，产卵孔周围组织发育停止，形成凹陷或长瘤；幼虫孵化后在果实中蛀食危害，造成落果或使果实腐烂不能食用，严重影响果蔬品质，丧失商品价值，严重威胁我国果蔬生产和出口贸易。目前桔小实蝇在国内主要分布于广东、广西、福建、四川、湖南、贵州、云南、海南、台湾等省区(李伟丰等，2007；张彬等，2008)，广东地区自1999年报道广州桔小实蝇大面积暴发危害以来(梁帆等，2008)，由桔小实蝇、南瓜实蝇和瓜实蝇等为害导致广东地区的经济损失每年高达33.67-129.87亿元(马兴莉等，2013)。因此，桔小实蝇的检疫鉴定工作至关重要。

随着现代仪器设备的发展，利用气相色谱技术对昆虫表皮碳氢化合物(Cuticular Hydrocarbons, CHCs)进行分析，其技术趋于成熟并被广泛应用于昆虫种间及复合种的分类鉴定(Kather and Martin, 2012)。昆虫表皮碳氢化合物稳定存在于昆虫的上表皮中，主要由直链或支链、饱和或不饱和的长链烃类构成，并和酯类、醇类及脂肪酸等组成脂质层(Lockey and Metcalfe, 1988)，主要作用是保护昆虫水分散失，防止农药、微生物侵入以及作为种间及种内信息化合物等功能(Lockey and Metcalfe, 1988; Howard and Blomquist, 2005)。利用表皮碳氢化合物组分分析实验操作简便，样品处理较为简单，时效性高，是形态学、细胞学和分子生物学分类方法的有效补充(张鹤等，2016)。

昆虫的表皮碳氢化合物组分与含量受环境因素、种内变异的影响，已有报道食物因素可以引起俄罗斯麦蚜Diuraphisnoxia、美洲沙漠蝗Schistocercashoshone、果蝇Drosophilamojavensis、阿根廷蚁Linepithemahumile的种内表皮碳氢化合物组分的改变(Bergmanetal., 1990; Chapmanetal., 1995; Stennett and Etges, 1997; Liang and Silverman, 2000; Kather and Martin, 2012)。由于桔小实蝇寄主范围广泛，取食不同的果蔬，是否以不同寄主植物为食物的种群间表皮碳氢化合物存在差异，这种差异是否会影响对种的判断，需要明确食物因素对实蝇种类鉴定的影响。为此，本研究以桔小实蝇的雄成虫为对象，通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，利用整体浸提及液体进样法，分析了取食番石榴、杨桃、芒果和人工饲料4种食物的桔小实蝇雄成虫表皮碳氢化合物，旨在明确食物因素对桔小实蝇表皮碳氢化合物组分与含量的影响，为检验检疫过程中实蝇种类的鉴定提供更为详实而可靠的数据支持。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

本试验供试桔小实蝇天然寄主种群分别采自广东省清远市的番石榴Psidiumguajava园(23.873°N/113.495°E)、杨桃Averrhoacarambola园(23.806°N/113.354°E)，以及广东省增城市芒果Mangiferaindica园(23.346°N/113.767°E)的落果，将落果移至室内实蝇化蛹箱内，箱底铺1-2 cm厚度湿沙，定期加水保湿，待成虫羽化。人工饲料种群由广东省出入境检验检疫局植检中心提供，参照袁盛勇等(2003)方法饲养，成虫饲料配方为酵母粉 ∶白砂糖=2 ∶1(m/m)。各种群置于温度25℃±1℃、相对湿度60%-70%，光暗周期(L ∶D)=14 h ∶10 h的饲养条件下，成虫羽化8 d后，用二氧化碳气体将其熏晕，取雄成虫参照吴佳教等(2009)方法进行种类鉴定，已鉴定的桔小实蝇雄成虫保存于-20℃备用。

1.2 桔小实蝇雄成虫表皮碳氢化合物的提取

取1头桔小实蝇雄成虫置于2.0 mL进样瓶内，加500 μL色谱纯正己烷(Sigma公司，美国)浸提10 min。用1 mL进样针将浸提液移至另一个2.0 mL进样瓶内，并用高纯N2吹至正己烷完全蒸发，再加20 μL正己烷重新溶解。以40 ng/μL正十八烷(Sigma公司，美国)为内标，在浸提液中加入2 μL内标溶液。将内标和浸提液的混合液移至150 μL玻璃内插管(Agilent公司，美国)，再将内插管放入1.5 mL进样瓶中，置于-20℃保存备用。采用Combi PAL自动进样器(CTC公司，瑞士)自动进样，每个供试样品进样2 μL。每处理重复7次。

1.3 仪器分析条件

供试样品用气相色谱GC7890A-质谱MS-5975C联用仪(Agilent公司，美国)分析，色谱柱为石英毛细管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；起始温度为50℃，以22℃/min升至270℃，再以2℃/min升至300℃，保留5 min。载气为高纯氦气，载气流速1 mL/min，柱头压为7.652 psi。电子轰击离子源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，扫描范围50-550 amu。进样口温度：290℃，不分流模式。接口温度300℃，溶剂延迟3 min。

1.4 数据分析

1.4.1桔小实蝇表皮碳氢化合物定性分析

参考林涛等(2016)方法。计算供试样品所含表皮碳氢化合物的科瓦茨保留指数(Kovǎts index, KI)。将获得的桔小实蝇表皮碳氢化合物质谱图，在NIST11库中检索，初步确认表皮碳氢化合物结构；对获得的桔小实蝇表皮碳氢化合物参数，如保留指数、特征离子峰和质荷比等信息与已发表文献的表皮碳氢化合物(Gohetal., 1993; Vanícˇkováetal., 2012)进行比对，确定桔小实蝇样品表皮碳氢化合物种类。

1.4.2桔小实蝇表皮碳氢化合物定量分析

参考林涛等(2016)方法。对12-25 min出峰的表皮碳氢化合物色谱峰解析。利用ChemStation色谱分析软件(Agilent公司，美国)对供试样品色谱图的含特征离子m/z=57.0的碳氢化合物提取(Vanícˇkováetal., 2012)，再对各组分色谱峰积分，获得其峰面积；对内标-正十八烷色谱峰也进行特征离子m/z=57.0的碳氢化合物提取并积分，确定其峰面积。根据以下公式计算供试样品表皮碳氢化合物组分的含量。

mi=(Ai×ms)/As

其中供试样品第i个待测组分的含量mi及峰面积Ai，内标含量为ms、峰面积为As。用t检验对表皮碳氢化合物各组分含量进行显著性检验。

1.4.3不同食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物组成比较

分析桔小实蝇番石榴、杨桃和芒果种群的碳氢化合物色谱图，以人工饲料种群为对照。对色谱图组成成分进行碳氢化合物特征离子m/z=57.0提取，再对各组分色谱峰积分，获得其峰面积。参照数据转换方法(Strohmetal., 2008)，对提取后的表皮碳氢化合物峰面积进行数据转换(林涛等，2016)。以各组分的转换峰面积为变量，对获得表皮碳氢化合物组分进行主成分分析(Principle Component Analysis, PCA)，实现多变量的降维；选择特征值大于1的特征变量为主成分，各主成分为原始表皮碳氢化合物的线性组合。再分别将3种寄主植物的桔小实蝇以及人工饲料对照的主成分作为判别分析的自变量，对其进行逐步判别分析(Discriminant Analysis, DA)，判断各处理间表皮碳氢化合物色谱图的相似度。在SPSS 16.0中进行试验处理间的t检验和双因素方差分析；利用Statistics 10.0(Statsoft, Inc.)软件，对试验数据进行主成分分析和逐步判别分析。

2 结果与分析

2.1 不同食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物组成

通过GC-MS分析获得了杨桃、番石榴、芒果3种寄主植物和人工饲料饲养的桔小实蝇表皮碳氢化合物色谱图，对第12-25 min出峰的表皮碳氢化合物色谱峰进行m/z=57.0提取，获得各样品表皮碳氢化合物的组分及峰面积(表1)。4种食物源的桔小实蝇共含有42种表皮碳氢化合物，其碳原子数为C29-C37。不同食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物种类略有不同，其中取食芒果的桔小实蝇表皮碳氢化合物种类数最多，含有39种；其次是取食杨桃的,含有38种；人工饲料饲养的含有36种，取食番石榴的种类数最少，为33种。4种食物源的桔小实蝇共有的碳氢化合物有29种，取食杨桃、番石榴、芒果的分别与人工饲料饲养的相比较，两两之间共有的碳氢化合物种类数分别为33、29和33种，其约为人工饲料饲养的桔小实蝇化合物种类的99.3%、91.4%和98.3%。

在获得的一共42种碳氢化合物中，正构烷烃、一甲基烷烃和二甲基烷烃分别有3、25和11种，有3种物质为未知化合物。在4种食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物中，一甲基含量最高，为57.92%-68.68%；其次是二甲基烷烃，为20.74%-33.68%；正构烷烃最少，为3.15%-10.58%。取食杨桃、番石榴和芒果的桔小实蝇的正构烷烃、一甲基烷烃均极显著地高于对照(P<0.01)，而二甲基烷烃含量极显著的低于对照(P<0.01)。

表1 不同食物源的桔小实蝇雄成虫表皮碳氢化合物组成和相对含量

续上表

保留指数Kovǎtsindex碳氢化合物a，bCuticularhydrocarbons碳数Carbonnumber相对含量(%)Relativecontentc杨桃Averrhoacarambola番石榴Psidiumguajava芒果Mangiferaindica人工饲料Artificialdiet3257dUnknown233--088±047-3267d9⁃，17⁃diMeC3233068±002064±004074±003035±0043275d3⁃MeC3233054±004--046±0053283d7⁃MeC3233091±004077±005096±002045±0043295dn⁃C3333153±012-104±011144±0213327d11⁃/13⁃/15⁃MeC33341247±044572±081948±0841389±1253353d13，17⁃/11，15⁃diMeC33351658±051458±1341576±099844±1003363d13⁃/21⁃MeC3435131±002062±007120±011068±0133374d3⁃MeC3334275±006134±013223±013150±0283386d5⁃MeC3336087±005064±006096±009-3399d3，7⁃/3，9⁃/3，11⁃diMeC3436273±011156±014254±006133±0183422d11⁃；13⁃/15⁃/17⁃MeC3435157±012091±01140±007073±0103432dUnknown335--050±003-3446d5⁃MeC3435067±004035±003077±013-3522d11⁃MeC3536115±007-078±009138±0203546d13，17⁃/15，19⁃diMeC3537245±008136±018306±056189±031正构烷烃n⁃Alkanes1058±122489±044315±019443±022一甲基烷烃Methylalkanes6868±0386079±0686176±0635792±074二甲基烷烃Dimethylalkanes2074±1083253±0913252±0653368±045

注：a，Me和diMe分别代表一甲基烷烃和二甲基烷烃；b，13-/11-MeC29表示支链可能位于11或13号碳原子上，11-,15-/13-,17-diMe29表示两个甲基位置可能是在11和15或13和17号碳原子上；c，表中数据为不同食物源的桔小实蝇雄成虫表皮碳氢化合物各组分峰面积的百分比(未经数据转换)；d，在主成分分析中变量载荷绝对值>0.7的表皮碳氢化合物组分。Note: a, Me and diMe stand for methylalkane and dimmethylalkane, respectively; b, 13-/11-MeC29 represent the position of branched chain may be on 11th or 13th carbon atom, 11-,15-/13,17-diMeC29 represents the position of two branched chain may be on 11th and 15th or 13th and 17th carbon atoms; c, Data were composed of the relative peak area in percentage (non-transformed)of each cuticular hydrocarbon fromB.dorsalisreared on different kinds of foods; d, Hydrocarbon compounds with factor loadings >0.7 on the five PCs with an eigenvalue greater than 1.

2.2 不同食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物比较及判别分析

采用主成分分析法对检测到的所有42个变量进行降维筛选，从总体上比较不同食物源的桔小实蝇雄成虫的色谱图相似度。对42种碳氢化合物的峰面积进行转换，以转换后的数据为变量，进行PCA分析(图1)。以主成分特征值大于1为界限，得出桔小实蝇表皮碳氢化合物5个主成分，即PC1、PC2、PC3、PC4和PC5，分别解释原始变量方差42.5%、32.6%、7.44%、4.18%和3.57%，其累积解释原始变量总方差90.3%，说明该5个主成分基本保留了原始变量的信息。

以5个主成分作为自变量，进行逐步判别分析(图1)。来自4种食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物色谱图存在显著性差异，所有供试个体均可被正确分类(Wilks,λ=0.0003,F=56.68,P<0.001)。5个主成分可显著区分4种食物源的桔小实蝇雄虫的表皮碳氢化合物色谱图(PC1, Partial Wilks,λ=0.029,P<0.0001; PC2, Partial Wilks,λ=0.096,P<0.001; PC3, Partial Wilks,λ=0.11,P<0.001; PC5, Partial Wilks,λ=0.33,P<0.001; PC4, Partial Wilks,λ=0.6,P=0.03)。统计分析还表明，不同食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物色谱图差异可用3个判别函数解释，其中判别函数1解释方差贡献率66.0%(特征值=35.7, 典型相关系数=0.986; Wilks,λ=0.0003,χ2=158.4,df=15,P<0.001)，判别函数2解释方差贡献率23.4%(特征值=12.7, 典型相关系数=0.963; Wilks,λ=0.01,χ2=88.2,df=8,P<0.001)，判别函数3解释方差贡献率10.6%(特征值=5.71, 典型相关系数=0.922; Wilks,λ=0.15,χ2=37.1,df=3,P<0.001)，判别分析构建判别函数的累计解释方差贡献率高达100%，说明这3个判别函数可完全解释各食物源的桔小实蝇间表皮碳氢化合物色谱图的差异。其中，判别函数1可将人工饲料饲养的桔小实蝇与其他3种寄主植物饲养的显著区分开(F=52.0,P<0.001;F=90.5,P<0.001;F=108.2,P<0.001)。判别函数2可将取食番石榴、杨桃和芒果的桔小实蝇图谱两两之间显著区分(F=30.4,P<0.001;F=36.2,P<0.001;F=43.5,P<0.001)。

图1 取食番石榴、杨桃、芒果和人工饲料(对照)的桔小实蝇雄成虫表皮碳氢化合物的判别分析特征根散点图Fig.1 Discriminant analysis based on the relative contents of 42 cuticular hydrocarbons from Bactrocera dorsalis male adults reared on Psidium guajava, Averrhoa carambola, Mangifera indica and artificial diet (control)

3 结论与讨论

食物与昆虫老化及营养感知通路活性密切相关，当食物成分发生改变时，黑腹果蝇Drosophilamelanogaster雌成虫的表皮碳氢化合物的组分含量发生改变，从而影响整个表皮碳氢化合物的组成(Fedinaetal., 2012)。食物因素不会改变南美按实蝇Anastrephaludens表皮碳氢化合物种类，但能影响各组分的含量(Carlsonetal., 1986)。本研究通过比较桔小实蝇天然寄主植物与人工饲料种群间的差异，发现取食杨桃、番石榴和芒果桔小实蝇表皮碳氢化合物种类分别为人工饲料的99.3%、91.4%和98.3%，共有物质占有很大比例，说明4种食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物的主要种类相同，相对稳定。对于不同昆虫种之间的鉴定，只要种内的差异远小于种间，其环境因素引起的变异对昆虫种类的鉴定则无影响(Kather and Martin, 2012)。取食杨桃、番石榴和芒果的桔小实蝇表皮碳氢化合物中的正构烷烃、一甲基烷烃均极显著地高于人工饲料对照(P<0.01)，而二甲基烷烃含量皆极显著的低于对照(P<0.01)，总体趋势一致。不同食物引起的差异主要体现在物质的含量上，而主要的组分种类相对稳定，说明食物因素不影响桔小实蝇表皮碳氢化合物的定性分析。

昆虫合成表皮碳氢化合物的来源有两种途径，一种是通过自身的绛色细胞合成(Howard and Blomquist, 2005)；一种是从摄取的食物获得(Blomquistetal., 1973)。分别以两种天然寄主植物与人工饲料喂养的果蝇Drosophilamojavensis表皮碳氢化合物的差异主要体现在某些组分上，并且食物因素带来的表皮碳氢化合物组分变化是果蝇个体间配偶选择的主导因素(Stennett and Etges, 1997)。在社会性昆虫中，阿根廷蚁Linepithemahumile通过猎食昆虫获取某类碳氢化合物，取食同种昆虫的个体间具有相同的表皮碳氢化合物，并以此作为识别同巢个体的化学线索。当取食的昆虫种类发生改变时，其原有蚁巢个体的表皮碳氢化合物发生改变，产生新的蚁巢气味，被认为是异巢个体引发相互攻击(Liang and Silverman, 2000)。本研究中，不同食物源的桔小实蝇表皮碳氢化合物组成种类基本相同，但通过判别分析仍可将各食物源的桔小实蝇区别开来，判别函数1可将人工饲料饲养的桔小实蝇与其他3种寄主植物饲养的显著区分开，判别函数2可将取食番石榴、杨桃和芒果的桔小实蝇图谱两两之间显著区分。因此，在桔小实蝇的鉴定过程中，可以通过提取种内共有物质作为种的特征峰，建立指纹图谱进行鉴定，还可以根据物质种类的差异来追溯其寄主植物。由于昆虫表皮碳氢化合物的代谢合成途径及其遗传基础还不完全清楚，这种表皮碳氢化合物组分的差别是否影响种间和复合种的鉴别有待进一步研究探讨。

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InfluencesoffoodfactorsoncuticularhydrocarbonsofBactroceradorsalisadults

LEI Yan-Yuan1, LIN Tao2, HE Li-Yun3, LU Li-Hua1*, HE Yu-Rong2, LI Qun-Chen1

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China; 2. College of Agriculture, South China Agriculture University, Guangzhou 510642, China; 3. Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China)

The oriental fruit flyBactroceradorsalisis an important quarantine pest which can damage fruit and vegetable. Cuticular hydrocarbons obtained from male adults ofB.dorsalisreared on different kinds of foods,Averrhoacarambola,Psidiumguajava,Mangiferaindicaand artificial diet were analyzed by Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)technology. Total of 42 cuticular hydrocarbon components, ranging from C29 to C37, were recovered by gas chromatography that represented major classes ofn-alkanes, methylalkanes and dimethylalkanes. The cuticular hydrocarbon components obtained fromB.dorsalisreared onA.carambola,P.guajavaandM.indicaaccount for 99.3%, 91.4% and 98.3%, as compared with the check artificial diet respectively. Chemometric methods (such as principal component analysis (PCA)and discriminant analysis (DA))were applied to the obtained data. We found some differences in relative percentage contents of components, but the cuticular hydrocarbons profiles ofB.dorsalisreared on different kinds of foods showed great similarities, suggesting that food factors did not affect the identification ofB.dorsalis. The characteristic peaks were identified and their GC-MS fingerprints were established, the findings generated from this study provided a data support for species identification of fruit fly during border inspection and quarantine.

Bactroceradorsalis; GC-MS analysis; cuticular hydrocarbons; food factors; male adult

广州市科技计划项目(201510010232)；“十二五”国家科技支撑计划(2015BAD08B02)

雷妍圆，女，1981年生，博士，助理研究员，研究方向为昆虫生物信息学及分子生物学，E-mail：leiyanyuan@163.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: lhlu@gdppri.com

Received: 2017-01-09; 接受日期Accepted: 2017-06-28

Q965;S433.89

：A

1674-0858(2017)04-0805-08

雷妍圆，林涛，何丽云,等.食物因素对桔小实蝇表皮碳氢化合物的影响[J].环境昆虫学报，2017,39(4):805-812.