快速鉴定新菠萝灰粉蚧的分子标记技术

马光昌，王晓妮，牛黎明，龚 治，温海波，金启安，彭正强

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口 571101)

快速鉴定新菠萝灰粉蚧的分子标记技术

马光昌，王晓妮，牛黎明，龚 治，温海波，金启安，彭正强*

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口 571101)

新菠萝灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley)是一种严重为害剑麻、番荔枝等经济作物的入侵性害虫。由于粉蚧类昆虫体型较小，且外部形态十分相似，难以达到快速准确识别。本文利用分子标记技术，研究了新菠萝灰粉蚧的快速鉴定方法。通过对新菠萝灰粉蚧、扶桑绵粉蚧、双条拂粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、大洋臀纹粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8种粉蚧的序列进行分析，针对新菠萝灰粉蚧设计了1对特异性引物，其扩增片段大小为552 bp(GenBank登录号为MF 363108)，该引物对其它7种粉蚧没有扩增能力。该引物不仅对新菠萝灰粉蚧成虫具有扩增效能，对1龄若虫、2龄若虫和3龄若虫都具有同样的扩增能力，其最低检出阈值为437.5 pg/μL。该技术的建立，实现了在剑麻等苗木调运过程中对新菠萝灰粉蚧的快速准确鉴定，同时对新菠萝灰粉蚧的检疫和监测也具有重要的意义。

新菠萝灰粉蚧；分子标记；快速鉴定；特异性扩增

新菠萝灰粉蚧Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley)属半翅目Hemiptera，粉蚧科Pseudococcidae，洁粉蚧属Dysmicoccus(Beardsley，1959)，被我国列为进境植物检疫性有害生物。该虫主要分布在美国夏威夷、墨西哥、巴哈马群岛、西印度群岛、哥伦比亚以及巴西等地区，是当地发生最严重的一种有害生物。

新菠萝灰粉蚧寄主广泛，主要为害剑麻、菠萝、柑橘、番茄、可可和香蕉等农林经济作物(Jaymaetal.，1992；林晓佳等，2013)，尤其是剑麻为害最为严重。在1998年，该害虫首次在我国海南省昌江县剑麻产区发现，为新入侵海南害虫。该害虫为胎生，有群集的习性，主要在剑麻的根、茎、叶片部位聚集，且可隐藏在剑麻叶片的裂缝和翘皮下(张小冬等，2008)。该害虫主要刺吸剑麻的汁液，以嫩叶为主，影响剑麻的生长发育，其分泌蜜露可引致煤烟病，直接影响剑麻的产量和质量，危害严重时可导致剑麻植株死亡。近年来，该虫在海南和广东剑麻产区暴发成灾，造成剑麻减产多达30%(陈泽坦等，2010)。

新菠萝灰粉蚧雌成虫虫体呈椭圆形，体外被白色蜡质分泌物覆盖。体长约2.5-4.5 mm，宽约1.5-2.0 mm。触角细索状，共8节，尾端有2根显著伸长的臀瓣刺。1龄若虫虫体呈长椭圆形，体色为淡黄色，体长约0.5 mm，单眼1对，红色。后期背部有少量均匀的蜡质分布。2龄若虫体色由黄褐色变淡灰色加深。达到3若虫时虫体被自身所分泌的蜡质物均匀覆盖(Beardsley，1965；汤祊德，1992；王子清，2001；张小冬等，2008)。由于蚧虫体极小，单凭传统的形态分类方法(个体大小、刚毛的长短和透明孔的有无等特征)进行鉴定耗时耗力。因此，本文针对新菠萝灰粉蚧研究了其快速分子鉴定技术，同时以扶桑绵粉蚧、双条拂粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、大洋臀纹粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等粉蚧为靶标进行了特异性检验。研究结果旨为有效地阻止新菠萝灰粉蚧通过剑麻苗木调运等方式从疫区向非疫区为害或向其他寄主蔓延，尽可能降低其所造成的经济损失和传播扩散的速度，保障国家的农业生产安全及其产品贸易安全。

1 材料与方法

1.1 供试材料

将野外采集到的粉蚧标本浸泡于95%酒精放入-20℃冰箱中备用。经传统的形态分类鉴定后，粉蚧种类主要有新菠萝灰粉蚧、扶桑绵粉蚧、双条拂粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、大洋臀纹粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8种。

1.2 粉蚧DNA提取

采用酚氯仿抽提法提取DNA。将单头粉蚧标本置于含有200 μL提取液(10 mmol/L Tris-HCI，1 mmol/L EDTA，1% SDS，pH 8.0)中，用封口枪头充分研磨；加入5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)于研磨后的匀浆液中，混匀后于56℃水浴2 h(每30 min混匀1次)；第一次抽提加1倍体积苯酚/氯仿(1 ∶1)于反应混合液中，混匀，离心10 min(4℃，10000 r/min)。吸取上清后用等体积氯仿按上法再抽提一次。吸取上清，用2倍体积100%冰冻乙醇沉淀1 h，离心20 min(4℃，12000 r/min)，弃上清，晾干后用30 μL无菌水充分溶解DNA于-20℃保存备用。

1.3 PCR扩增与克隆测序

采用核糖体rDNA区通用引物ITS18S：(5′-TACACACCGCCCGTCGCTACTA-3)和ITS5.8S：(5′- ATGTGCGTTCRAAATGTCGATGTTCA-3′)进行扩增。引物由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应采用25 μL反应体系，其中含有2 μL DNA溶液，2.5 μL10×Pfu buffer，0.6 μL Mg2+(100 mmol/L)，0.5 μL 10 mmol/L dNTP混合液，引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μL，北京全式金生物技术有限公司)0.5 μL，17.3 μL ddH2O。反应条件为：94℃变性5 min；95℃ 20 s，53℃ 40 s，72℃ 1 min，35个循环后72℃保温8 min。取2.5 μL扩增产物于含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下检测结果并拍照。

《二月》中第一封信和第四封信问句较为集中,分别为13句、15句。由二句组合、三句组合、四句组合等。例如:

所得目的片段用PCR产物直接双向测序，测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4 序列分析与新菠萝灰粉蚧特异性引物设计

对获得的8种不同粉蚧的序列进行比对分析，针对新菠萝灰粉蚧，找到该虫与其它粉蚧的特异区域，利用Oligo 6.0软件，在这个区域设计新菠萝灰粉蚧的特异性引物D. ne-F：5′-ATTGAACGA CCGCAGTGA-3′和D.ne-R：5′-GTCTGTTTATACTT GGGG-3′(上海生工生物技术有限公司合成)，扩增片段552 bp(GenBank登录号为MF 363108)。PCR的反应体系为15 μL，其中，10×PCR Buffer 1.5 μL，各2.5 mM的dNTP Mixture 1.2 μL，10 μM D.ne-F/D. ne-R引物各0.2 μL，25 mM Mg2+1.2 μL，BSA 0.3 μL，TaKaRa Taq 0.2 μL，10 ng模板DNA 0.6 μL，ddH2O 9.6 μL；PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸10 min。取2.5 μL扩增产物于含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在紫外光下检测结果并拍照。

1.5 新菠萝灰粉蚧引物的种特异性及灵敏性检验

分别以新菠萝灰粉蚧、扶桑绵粉蚧、双条拂粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、大洋臀纹粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧的DNA为模板，检验新菠萝灰粉蚧特异性片段扩增引物D.ne-F/D.ne-R的种特异性。与此同时，提取不同虫态(1龄若虫、2龄若虫、3龄若虫和成虫)的新菠萝灰粉蚧的DNA为模板，对目的片段扩增效果进行检验。取单头成虫原模板DNA溶液(140 ng/μL)稀释10倍后以2倍进行递减稀释至437.5 pg/μL，然后以稀释后的浓度为模板(14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL)进行最低检出阈值的测定。每一种类和不同虫态的样本分别检测3头。

2 结果与分析

2.1 新菠萝灰粉蚧引物的种特异性检测

以所设计的D.ne-F/D.ne-R新菠萝灰粉蚧种特异性引物分别对新菠萝灰粉蚧、扶桑绵粉蚧、双条拂粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、大洋臀纹粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8种粉蚧的DNA模板进行扩增和电泳检测，结果如下(图1)：该引物只能针对新菠萝灰粉蚧扩增出552 bp大小的片段，而对其它粉蚧不具有扩增能力，表明所设计的D.ne-F/D.ne-R为新菠萝灰粉蚧种特异性引物。

图1 用D.ne-F/D.ne-R特异性引物对新菠萝灰粉蚧及近缘种扩增的结果Fig.1 The amplification result of Dysmicoccus neobrevipes and its related species using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子标记，1，2，3为新菠萝灰粉蚧；4，5，6为扶桑绵粉蚧；7，8，9为双条拂粉蚧；10，11，12为杰克贝尔氏粉蚧；13，14，15为大洋臀纹粉蚧；16，17，18为木槿曼粉蚧；19，20，21为甘蔗粉蚧；22，23，24为木瓜粉蚧。Note: M: DNA Maker, 1, 2, 3: Dysmicoccus neobrevipes; 4, 5, 6: Phenacoccus solenopsis Tinsley; 7, 8, 9: Ferrisia virgata Cockerell; 10, 11, 12: Pseudococcus jackbeardsleyi; 13, 14, 15: Planococcus minor Maskell; 16, 17, 18: Maconellicoccus hirsutus; 19, 20, 21: Saccharicoccus sacchari Cockerell; 22, 23, 24: Paracoccus marginatus.

2.2 新菠萝灰粉蚧种特异性引物对不同虫态和不同稀释倍数模板DNA检测

以新菠萝灰粉蚧不同虫态的DNA为模板，以D.ne-F/D.ne-R为特异性引物进行PCR扩增，该引物对不同虫态的新菠萝灰粉蚧都能稳定的扩增出552 bp大小的片段(图2)；此外，当将单头成虫模板DNA稀释为14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL等不同浓度时进行PCR扩增和电泳检测，结果表明，当稀释为437.5 pg/μL时，仍然可以有效、特异性地扩增出552 bp大小的片段(图3)，表明该引物具有较高的灵敏性。

图2 用D.ne-F/D.ne-R特异性引物对新菠萝灰粉蚧不同虫态扩增的结果Fig.2 The amplification result of different developmental stages of Dysmicoccus neobrevipes using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子标记，1，2，3为1龄若虫；4，5，6为2龄若虫；7，8，9为3龄若虫；10，11，12为成虫。Note: M: DNA Maker, 1, 2, 3: 1st instar; 4, 5, 6: 2nd instar; 7, 8, 9: 3rd instar; 10, 11, 12: adult.

图3 用D.ne-F/D.ne-R特异性引物对新菠萝灰粉蚧的最低检出阈值Fig.3 The minimum threshold for Dysmicoccus neobrevipes using specific primer D.ne-F/D.ne-R注：M：分子标记，1-6分别为14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL。Note: M: DNA Maker, 1-6 represent14 ng/μL、7 ng/μL、3.5 ng/μL、1.75 ng/μL、875 pg/μL、437.5 pg/μL.

3 结论与讨论

本文通过对新菠萝灰粉蚧、扶桑绵粉蚧、双条拂粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、大洋臀纹粉蚧、木槿曼粉蚧、甘蔗粉蚧和木瓜粉蚧等8种粉蚧的ITS序列进行测定，通过序列分析比对，针对新菠萝灰粉蚧设计出了一对种特异性引物，该引物可以特异性的扩增出552 bp大小的片段，而对其它7种粉蚧没有扩增能力，能有效快速地鉴定出新菠萝灰粉蚧；该引物不仅对新菠萝灰粉蚧的成虫具有良好的扩增能力，而且对单头1龄若虫、2龄若虫和3龄若虫也都有同样的扩增效果；此外，该引物还可以检测出最低浓度为437.5 pg/μL，具有较强的敏感性。然而由于粉蚧种类较多，有许多种类在本文中未曾涉及，因此，对所设计的新菠萝灰粉蚧特异性引物尚需要做进一步的检测。

到目前为止，对粉蚧类昆虫的鉴别主要是依据其成虫外部形态特征，但粉蚧类昆虫是外部形态十分相似的一类害虫，有些种类鲜见雄虫，可供比较的形态学特征是有限的，而且有些形态分类特征并不稳定，如有些粉蚧的个体大小、刚毛的长短和透明孔的有无都可能受外部环境的影响，低龄若虫形态分类特征更加不稳定(Cox，1983)。近年来，随着分子生物学技术的广泛应用，粉蚧类昆虫的鉴定取得了重大进展。Beuning等(1999)通过获得Pseudococcusviburni(Signoret)、P.longispinus(Targiono-Tozzetti)、P.calceolariae(Maskell)和P.similans(Lidgett)的ITS序列，并设计特异性引物来对这4种粉蚧进行了分子鉴定，而此特异性引物还可用于成虫、卵和若虫等材料的鉴定；徐浪等(2016)利用mtDNA COI基因设计了两组特异性引物和MGB探针，应用TaqMan实时荧光PCR方法对新菠萝灰粉蚧和菠萝灰粉蚧进行了快速准确鉴定；徐浪等(2013)测定了7种粉蚧的COI序列，并与BOLD和Genbank中的DNA条形码数据库比对，实现了相关蚧虫的快速准确鉴定。本文所设计的新菠萝灰粉蚧种特异性引物能够不受其发育阶段和环境因素制约，准确、简单、快速的鉴定出新菠萝灰粉蚧，该技术的建立，将为检验检疫部门提供有效的检测方法，同时对防治外来粉蚧也具有重要意义。

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MolecularmarkertechniqueforrapididentificationofDysmicoccusneobrevipes(Beardsley)

MA Guang-Chang, WANG Xiao-Ni, NIU Li-Ming, GONG Zhi, WEN Hai-Bo, JIN Qi-An, PENG Zheng-Qiang*

(Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agriculture Science, Haikou 571101, China)

Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley) is an invasive pest, which tremendously harms economic crops includingAgavesisalanaandAnnonasquamosa. It is very hard to rapidly and accurately distinguishing mealybugs because of their small size and similarity in external morphology. In this study, we had developed a method for the rapid differentiation ofD.neobrevipesby molecular marker technique. Sequences ofD.neobrevipes、PhenacoccussolenopsisTinsley、FerrisiavirgataCockerell、Pseudococcusjackbeardsleyi、PlanococcusminorMaskell、Maconellicoccushirsutus、SaccharicoccussacchariCockerell andParacoccusmarginatuswere analysed. A pair of specific primers which is specific toD.neobrevipeswas designed. A single 552 bp (GenBank accession number: MF 363108) fragment was amplified using the specific primers only inD.neobrevipes. No fragments were amplified using the specific primers in other mealybugs. The amplification ability of specific primer was proved to be capable for not only adults but also 1st, 2ndand 3rdinstar ofD.neobrevipes. Moreover, the assays was capable of detecting 437.5 pg/μL. This technique should be useful tool for pest rapid diagnosis, quarantine and monitoring during transportation of seedlings likeA.sisalana.Keywords:Dysmicoccusneobrevipes(Beardsley); molecular marker; rapid identification; specific amplification

公益性行业(农业)科研专项经费“南繁区生物安全监测预警及控制关键技术研究与示范”(201403075)；国家重点研发计划项目(2016YFC1201200)

马光昌，男，1981年生，山西人，硕士，助理研究员，研究方向为入侵害虫生物防治，E-mail：mgc53@126.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: lypzhq@163.com

Received：2017-06-01; 接受日期Accepted: 2017-06-21

Q963；S412

：A

1674-0858(2017)04-0893-05

马光昌，王晓妮，牛黎明,等.快速鉴定新菠萝灰粉蚧的分子标记技术[J].环境昆虫学报，2017,39(4):893-897.