高效液相色谱检测技术在饲料分析中的应用和重要作用

吕丽卿，刘晓玥

（北京三元种业科技股份有限公司饲料分公司，北京 101105）

高效液相色谱检测技术在饲料分析中的应用和重要作用

吕丽卿，刘晓玥

（北京三元种业科技股份有限公司饲料分公司，北京 101105）

高效液相色谱检测技术作为饲料成分检测手段已被广泛应用和认可，其涉及的检测领域涉及饲料中营养物质和非营养物质，如维生素、氨基酸、药物残留、真菌毒素和三聚氰胺等。在饲料国家标准中高效液相色谱法是应用最广泛的检测技术，可见此技术在仪器分析中发挥着重要的作用，具有很广阔的应用前景。

高效液相色谱；饲料；营养物质；非营养物质；分析；应用

高效液相色谱法目前是饲料检测中应用最广泛的一项检测技术，随着饲料行业在中国农业产业链中的不断提升，预混料生产企业也都要求具备此检测设备，如何让它的能力发挥出来，是全体饲料检测工作者的责任和使命。

1 高效液相色谱技术介绍

1.1 高效液相色谱发展历程

液相色谱定义是二十世纪早期由俄罗斯植物学家Mikhail S·茨维特提出的。他最先尝试在装满颗粒的柱子上使用溶剂来分离从植物中提取的化合物。茨维特用颗粒填满开口的玻璃柱。他发现两种特殊的材料，粉笔末和氧化铝很有用。他将样品倒入柱中，并让样品流过颗粒床，随后加入纯溶剂，随着样品由于重力自上而下流过柱子，可看到不同颜色的谱带被分开，因为有些组分比另外一些移动得快。他将这些分开的不同颜色的谱带与样品中原有的不同化合物相关联。他还根据每一种化合物对填料的化学亲和性强弱，提出了分析这些化合物的分离规律。与颗粒填料有较强亲和性的化合物移动慢，与溶剂有较强亲和性的化合物移动快。这个过程可这样描述：样品中的化合物在流动的溶剂（流动相）与固体颗粒（固定相）间的分布不一样。这样使每一种化合物以不同的速度移动，从而产生了化合物之间的分离。高效液相色谱（HPLC）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末期迅速发展起来的用于有机物定量分析的仪器分析方法。HPLC是在经典液相色谱的基础上，采用全多孔或非多孔高效微粒（1.7～10μm）固定相制备的色谱柱，由高压输液泵输送流动相，用高灵敏度检测器进行检测，实现了高柱效、高选择性和高灵敏度的快速分析，已成为有机物定量分析的主要分析工具。

高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。

1.2 高效液相色谱分析原理

（1）高效液相色谱分析流程。由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

（2）高效液相色谱的分离过程。同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A、C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离的目的。

（3）高效液相色谱的数据采集处理。当分开的化合物谱带离开色谱柱后，进入检测器。检测器带有可以在流动相背景下检测到每个分开的化合物谱带的流通池。一个合适的检测器有能力辨别化合物的存在，并发送相应的信号到计算机数据站。

2 高效液相色谱在饲料分析与检测中的应用

饲料成分非常复杂。一般将饲料成分分为营养物质和非营养物质两大类，高效液相色谱在分析这两类物质分子组成和含量上具有独特优势。

2.1 营养物质分析中的应用

（1）检测饲料中维生素。维生素是一种维持动物正常生理功能所必需的低分子有机化合物。与其他营养素相比，动物所需维生素的量很少，通常以微克（ug）或毫克（mg）计。但维生素又不同于微量元素，因为有机化合物，也与构成动物生长的身体物质和贮存物质的营养素不同。缺乏维生素可引起动物代谢紊乱，影响动物健康和生产性能。动物获得维生素最主要的途径是饲料。目前情况下添加人工合成的维生素类饲料添加剂是补充饲料维生素含量不足的最主要途径。按照溶解性，维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素。除了氯化胆碱外，全部单一维生素均可运用高效液相色谱法测定，如VA、VD3、VE、VK3、VC、VB2、VB12等。

表1 维生素单体高效液相色谱法检测方法汇总

（2）检测饲料中氨基酸。动物对蛋白质的需求本质上是对氨基酸的需求。因此饲料中氨基酸的种类和含量是衡量其质量高低的一项重要指标。氨基酸的测定方法很多，国家标准（GB/T 18246-2000）对饲料中氨基酸测定采用柱后衍生、用茚三酮作为衍生剂试剂的离子交换色谱法。而色氨酸的测定，目前多采用不同浓度、不同种类强碱水解样品，再用比色法或高效液相色谱法（HPLC）等定量。安捷伦公司分析方法推荐用邻苯二甲醛、9-芴甲基氯甲酸酯（OPA-FMOC）柱前衍生反相高效液相色谱法，以C18氨基酸分析柱，紫外检测器，30min内 17种氨基酸得到了分离。氨基酸浓度在 10～1000 pmol/μL范围内，其峰面积与氨基酸浓度的线性相关系数均大于0.996。17种氨基酸的加标回收率在83.9%～109.8%范围内。

（3）检测饲料中有机酸。饲料添加剂中有酸化剂的使用已被广泛认可，但随着价格的差异，也会存在一些掺假问题，因为传统的滴定方法无法区分酸性物质的种类，故高效液相色谱法的应用，解决了这个问题，国家标准中对有机酸的检测进行了规定：饲料中丙酸和丙酸盐的测定GB/T 17815-1999；饲料中酸化剂柠檬酸、富马酸和乳酸的测定GB/T 23877-2009。在实际的检测工作中有很好的指导意义。

2.2 非营养物质分析中的应用

（1）检测饲料中多种β-兴奋剂。β-兴奋剂是从天然儿茶酚胺衍生合成的一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇类衍生物，大体分为苯胺型（如克伦特罗等）、苯酚型（如沙丁胺醇、莱克多巴胺等）、苯二酚型（如特布他林、盐酸多巴胺等）三大类。大量研究表明，在动物日粮中β-兴奋剂可以提高饲料转化率和增加瘦肉率，长期使用该类化合物会严重危害动物的肝脏、肾脏等内脏器官，且在动物内脏器官中的存留时间较长，一般烹饪过程很难使其失活，所以β-兴奋剂可通过食物链进入体内，严重危害人类健康。除了美国食品与药物管理局（FDA，2004）批准仅莱克多巴胺可应用于猪和牛饲料外，其它欧美国家均禁用该类药物。我国农业部公告第235号（2002）规定严禁在畜牧生产上使用各种β-兴奋剂类药物。饲料中β-兴奋剂的相关检测方法较多，对盐酸克伦特罗HPLC及GC-MS测定方法进行了比较，表明HPLC可作为一般定量测定方法，与GC-MS一起作为仲裁法，现两种方法均已作为农业部标准颁布实施。

（2）检测饲料中的真菌毒素。①饲料中的真菌毒素——黄曲霉毒素，它是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的，主要包括B1、B2、G1和G2这4种毒素，其中，B1是毒性最强和危害最大的一种，B2和G2分别是B1和G1的双羟基衍生物。当前，饲料中黄曲霉毒素的检测方法主要采用薄层色谱法、酶联免疫法、免疫亲和柱法以及荧光光度法等，随着HPLC技术应用的日益普及，选用免疫亲和层析柱净化、高效液相色谱荧光检测器进行检测的方法对饲料中黄曲霉毒素 B1、B2、G1和G2进行检测研究。②饲料中的真菌毒素——T-2毒素，主要由镰孢菌属产生，其检测方法较多。目前，免疫亲和柱净化结合高效液相色谱法应用效果较好。③饲料中的真菌毒素——玉米赤霉烯酮（ZEN），又称F2毒素，由镰刀菌属产生的一种真菌毒素，可引起人和动物雌激素过多综合症，具有生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性及可疑致癌性等。ZEN主要污染玉米、小麦等谷物类作物及其产品，由于其毒性，我国规定人用的小麦、玉米中ZEN含量不超过60μg/kg，饲料中ZEN含量不超过500μg/kg。国标GB/T 1954-2004规定，玉米赤霉烯酮的测定方法有薄层色谱法和酶联免疫吸附法，但这些方法的样品提取操作繁琐耗时，需消耗大量的有机溶剂。近年来样品处理方法不断得到改进，同时结合高效液相色谱法的测定方法得到广泛应用。

国家标准在真菌毒素中检测方法汇总如表2所示。

表2 真菌毒素检测方法国家标准汇总

（3）检测饲料中的抗生素。饲料产品中抗生素药物残留问题一直是饲料执法部门抽查的核心内容，生产过程中的交叉污染、配方中使用过量等情况，都会造成饲料产品中存在不符合规定的药物添加问题。液相色谱法是最佳的检测手段，它为药物含量及药物残留的检出提供了仪器保障。也为饲料产品质量安全提供了保障，企业可以自行完成各环节监察工作。国家标准中在药物检测方法的规定最为全面，包括四环素类、氯霉素类、聚醚类、多肽类及化学合成类药物，高效液相色谱可以在此领域的检测发挥到极致。

（4）检测饲料中的三聚氰胺。三聚氰胺（melamine）简称三胺，又名蜜胺，学名三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，由于其分子中含有大量氮元素，而普通的全氮测定法不能排除这类伪蛋白氮的干扰，因而一些厂商为了降低成本而添加这种化工原料，以提高产品中蛋白质含量。作为饲料中的非法添加，已得到广泛关注，国家法律规定饲料中三聚氰胺含量小于2.5ppm，并制定了行业标准NY/T 2071-2011饲料中三聚氰胺的测定，为饲料检测工作中起到了很好的指导作用。

随着饲料业的不断发展、现代仪器的不断进步和在饲料企业中的广泛应用，高效液相色谱技术发挥着非常重要的作用，它应用广泛，适用领域宽，改进和提升的空间较大，越来越被检测人员所重视和推崇，液相色谱检测技术已不再高深和无法驾驭，它也在随着时代的步伐慢慢靠近人们日常的检测工作中，成为最可信任的检测工作，为产品安全提供最有效地保障，在饲料分析检测中发挥更加广泛的作用，做出更加卓越的贡献。

［1］王传蓉.高效液相色谱技术在饲料分析中的应用［J］.中国乳业，2012，130（10）：46-48.

［2］王玲，杨璐玲，孙国强.高效液相色谱技术在饲料分析中的应用研究进展［J］.中国饲料，2016，（6）：31-39.

吕丽卿，主要研究方向：饲料。