高通量与低通量血液透析对血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白产物和蛋白质羰基的影响

罗 祁，李 霞*

（中南大学湘雅医院血液净化中心，湖南 长沙 410000）

高通量与低通量血液透析对血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白产物和蛋白质羰基的影响

罗 祁，李 霞*

（中南大学湘雅医院血液净化中心，湖南 长沙 410000）

目的 探讨高通量血液透析对慢性血液透析患者中血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白产物及蛋白质羰基的影响。方法 从我院招募的慢性低通量血液透析患者20例。研究初期，所有患者改用高通量血液透析8周（A期），随后低通量血液透析2周作为洗出期；然后，患者再次进行8周的低通量血液透析期（B期）。在A期（高通量前期和高通量后期）和B期（低通量前期和低通量后期）开始和结束时采集透析前血清样品。使用ELISA检测血清β-2微球蛋白，分光光度法测定晚期氧化蛋白产物和蛋白质羰基。结果 高通量血液透析后血清β-2微球蛋白和晚期氧化蛋白产物水平显著低于高通量血液透析前（分别为p=0.031和0.036），但蛋白质羰基未观察到显著变化（p=0.8）。低通量血液透析后期血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白产物和蛋白质羰基都显著高于低通量血液透析前水平（分别为p=0.0002、0.019和0.0002）。低通量血液透析后期血清β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白产物显著高于高通量血液透析后期（分别为p＜0.0001和p=0.0005），但蛋白质羰基无显著差异（p=0.112）。高通量血液透析后期蛋白质羰基与晚期氧化蛋白产物（p=0.013）和B2MG（p=0.01）呈正相关。高通量血液透析后期蛋白质羰基与β-2微球蛋白呈正相关（p=0.036）。结论 高通量血液透析能降低血清β-2微球蛋白和蛋白质羰基含量，而晚期氧化蛋白产物则不受影响。另一方面，低通量血液透析可能导致三种标记物水平的增加。因此高通量血液透析相对于低通量血液透析能更好地去除尿毒症毒素。

高通量；低通量；血液透析；β-2微球蛋白；蛋白质羰基；晚期氧化蛋白产物

尿毒症的主要临床特征是体内毒素不能排出，体内毒素不能排出不仅对各种代谢过程均有不利影响，而且和尿毒症发病率和死亡率密切相关。根据毒素分子大小和疏水性可将其分为：（a）水溶性小分子（分子量＜500 Da），如尿素。可通过任何透析方式清除。（b）中等量分子（分子量＞500 Da）。（c）结合蛋白质的疏水性溶质，如酚类化合物[1]。

中等量分子包括β-2微球蛋白（beta-2 microglobulin，B2MG）、晚期糖基化终产物（advanced glycation endproducts，AGE）、晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products，AOPP）和其他肽类。使用大孔膜高通量血液透析清除这些大分子相对于使用小孔膜的低通量血液透析更有效[2]。

B2MG形成人类白细胞抗原I类分子的β链，存在于大多数真核细胞表面和体液，主要由肾脏排泄，肾脏外清除可忽略不计。B2MG分子量为11.8 kDa，已被广泛应用于评估中等量分子的透析清除效率[3]。血清B2MG水平长期升高与慢性血液透析患者透析相关淀粉样变发展相关。

透析期间，与透析器膜血液接触会激活单核细胞和嗜中性粒细胞，从而导致大量反应性氧物质产生，其所诱发的氧化应激促进了动脉粥样化发展，同时也增加了慢性血液透析患者心血管疾病发生率[4]。

晚期氧化蛋白产物（Advanced oxidation protein products，AOPP）是氧化应激期间氯化氧化剂与血浆蛋白反应产生的尿毒症毒素[5]。酪氨酸等氧化氨基酸残基导致二氮芥形成、蛋白质交联、片段化以及酶或其他功能丧失。晚期氧化蛋白产物根据其交联配体不同具有不同的分子量。除了作为氧化应激的标志物，AOPP还具有促进前炎症反应的作用。

碳水化合物和脂质的氧化可产生反应性羰基（reactive carbonyl groups，RCO）。活性氧（reactive oxygen species，ROS）和RCO与蛋白质结合导致血浆和组织中羰基化功能障碍蛋白质形成。蛋白质羰基（PCO）含量是氧化应激依赖性细胞损伤的良好标志物。已有报道称尿毒症患者血浆蛋白羰基化物水平普遍上升[6]。此外，蛋白质碳水化合物是晚期糖基化终产物（advanced glycation end-products，AGE）前体，作为中等量分子毒素在肾功能衰竭进展中起到了重要作用。

由于中等分子量尿毒症毒素在其分子量和蛋白质结合方面的异质性可能影响其血液透析清除率，因此本实验旨在研究慢性血液透析患者高通量与低通量血液透析对血浆尿毒症毒素β-2微球蛋白、晚期氧化蛋白产物以及氧化应激标志物蛋白羰基的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从我院招募患有晚期末期疾病（end stage renal disease，ESRD）的慢性正常血液透析的患者20例，其中，男16例，女4例，所有患者临床状况稳定。以20名健康年龄匹配受试者作为对照组，吸烟者和接受抗肿瘤或抗氧化治疗的受试者被排除在研究之外。所有研究参与者均已签署知情同意，该研究由南华大学伦理委员会批准。

1.2 实验设计

研究开始前，所有患者均接受8周的低通量血液透析。研究开始时，所有患者改用高通量血液透析8周（A期），随后低通量血液透析2周（W期）作为洗出期排除遗留效应；然后，患者再次进行8周低通量血液透析期（B期）以维持治疗。在A期（高通量前期和高通量后期）和B期（低通量前期和低通量后期）开始和结束时采集透析前血清样品。使用ELISA检测B2MG，分光光度法测定AOPP和PCO。膜类型不同可能对血液透析患者氧化状态产生不同影响，高通量和低通量膜都由相同的料（合成聚酰胺共混膜：分别为聚合物170H和聚合物17L，Gambro Co，USA）制成。

所有患者使用碳酸氢盐透析液每周透析3次，透析液流速为500 mL/min，每个疗程持续4～6 h不等，血流速度范围为250～400 mL/min，平均值为（323±42.2）mL/min。调整血液透析期间持续时间和血液流速以达到＞65%尿素清除率（URR）。所有患者达到目标血红蛋白水平（11～12 g/dL）后使用维持剂量的人重组红细胞生成素。研究期间患者未接受输血治疗。

高通量A期（前高通量透析期）第一次透析之前采集血样，在此期（后高通量透析期）结束时采集另一个透析前样品。B期（前低通量透析期）开始时取第三次透析前样品，在此期（后低通量透析期）结束时取第四次透析前样品。

所有患者进行全面病史采集和临床检查。此外，还进行了4周全血象检查。调节红细胞生成素剂量以将血红蛋白水平维持在11～12 g/dL。每月检测一次透析前和透析后血清尿素水平以计算尿素还原比：URR =（尿素透析前-尿素透析后）/尿素透析前-100。

对每个患者采集的四个静脉血样本中进行以下实验室检查，所有对照组受试者接受同样的检查。

1.3 β-2微球蛋白测定

使用市售试剂盒进行酶联免疫吸附测定（ELISA）测定β-2微球蛋白。

1.4 晚期氧化蛋白产物（AOPP）测定

使用分光光度法测定AOPP。96孔微量滴定板中，使用20 μL乙酸酸化200 μL血清（使用磷酸盐缓冲盐水以1：5的比例稀释）。立即在340 nm处以含有200 μLPBS、10 μL1.16 mol/L碘化钾和20 μL乙酸为空白对照读取反应混合物的吸光度。使用由氯胺-T标准溶液（Sigma-Aldrich，USA）构建的标准曲线测定AOPP含量。AOPP浓度以1 mol/L氯胺-T当量表示。

1.5 蛋白羰基检测

使用OxiSelect蛋白质羰基分光光度测定试剂盒通过分光光度法测量蛋白质羰基。该测试以蛋白质羰基与2，4-二硝基苯肼（DNPH）的衍生化为基础。在375 nm通过分光光度法检测产生的蛋白质-水性区的量。以nmol/mg蛋白质表示羰基水平。

在贝克曼化学自动分析仪上测定血清蛋白，并使用蒸馏水调节为1 mg/mL。将1 mL DNPH加入到250 μL稀释的血清中。孵育后，使用1.25 mL三氯乙酸20%沉淀蛋白质。用1 mL乙醇/乙酸乙酯（1:1v/v）洗涤蛋白质沉淀以除去游离DNPH，并将其溶于250 μL1M NaOH中。读取370 nm吸光度，使用摩尔吸光系数DNPH（22·103 mol-1 cm-1）计算羰基含量。由于洗涤时可能损失一些蛋白质，通过Lowry测量最终溶解沉淀中蛋白质含量20。以蛋白质含量为标准化的羰基含量，并以nmol/mg蛋白质表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行处理。使用Mann Whitney检验进行患者和对照组之间的比较。使用Wilcoxon符号秩检验分析患者组中研究参数的变化。使用斯皮尔曼相关性检验来研究变量之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 受试者一般资料

20例慢性血液透析患者的临床数据如表1所示。高血压是慢性肾脏疾病最常见的原因（30%），而有15%患者病因尚不明确。3例患者（15%）心脏肥大，2例患者（10%）糖尿病性视网膜病变。表2给出了血液透析患者与对照组的基础生化数据。血液透析患者血清B2MG、AOPP和PCO水平明显高于对照组（P＜0.0001）。见表1、表2。

表1 慢性透析患者临床参数

表2 慢性透析患者和健康受试者基线临床参数和尿毒症毒素比较

2.2 高通量和低通量患者对慢性透析患者B2MG、PCO及AOPP的影响

与前高通量期相比，高通量透析期末期（后高通量期）血清B2MG和PCO水平显著降低（分别为P=0.031和P=0.036）。另一方面，此期未观察到AOPP水平显著变化（P=0.8），见表3。此期内B2MG、AOPP和蛋白质羰基的平均百分比变化（±s，SEM）为（-7.97±6.84）%、（1.82±3.63）%和（-7.69±5.04）%，见图1。

高通量期（A期）和低通量期（B期）初期研究参数水平相当，表明洗出期清除彻底（B2MG：P=0.313、AOPP：P=0.472、蛋白质羰基：P=0.66）。

8周低通量血液透析（后低通量期）结束时与此期初期（前低通量期）相比，B2MG、AOPP和蛋白质碳水化合物水平显著增高（P=0.0002、0.019和0.0002），见表3。B期B2MG、AOPP和PCO的平均百分比变化（±s，SEM）分别为：（30.31±6.43）%、（9.13±3.27）%和（31.03±5.05）%，见图1。

图1 高通量和低通量透析后患者B2MG、PCO及AOPP变化情况

后低通量透析期B2MG和蛋白质羰基化物的水平显著高于后高通量透析期（分别为P＜0.0001和P=0.0005）。另一方面，AOPP水平无显著差异（P=0.112）。高通量（P=0.41）或低通量（P=0.57）血液透析后血清尿素水平未观察到显著变化。

前高通量透析后，蛋白质羰基和AOPP在基线处正相关（r=0.569，P=0.013）。蛋白质羰基也与B2MG正相关（r=0.591，P=0.01）。A期末，后高通量透析时蛋白质羰基与B2MG正相关（r=0.421，P=0.036）。

3 讨 论

高血压和心血管疾病等慢性血液透析相关疾病的发生，被认为与低通量血透使用的小孔膜难以去除中分子尿毒症毒素并导致其在人体内蓄积有因果关系。最新临床研究表明，可通过使用大孔径高通量血液透析膜、增加透析频率或延长透析时间来增强对这类化合物的清除，从而能提高终末期肾病患者的生存率和生活质量[7]。

表3 高通量和低通量透析对慢性透析患者B2MG、PCO及AOPP含量的影响

本研究探讨了高通量与低通量血液透析对中等量分子的代表：血清β-2微球蛋白和晚期氧化蛋白产物水平的影响,同时还研究了氧化应激标志物蛋白质羰基的水平。结果表明，研究开始时慢性血液透析患者透析前血清B2MG水平基线值相对于对照组显著增高，这与以往研究结果一致[8]。Okuno等研究表明血清β-2微球蛋白水平是血液透析患者死亡率的重要的独立预测因子，提示降低这些患者血清β-2微球蛋白的重要临床意义[9]。

本研究中，使用高通量膜血液透析8周后测得的血清B2MG水平显著降低，而使用低通量透析其水平则显著升高。同样，另有研究表明，高通量透析透析前B2MG水平显著低于低通量透析。

B2MG循环中的肾外清除率几乎可以忽略不计，因此通常将其当作“中等量分子”范围内尿毒症毒素的标记，特别是用于评估透析效率。然而，β-2微球蛋白水平不仅与透析清除率相关，同时也与标志着尿毒症中毒水平的炎症因素有着密切联系。此外，其他几个中等量分子与蛋白质相关，因此它们的动力学表现和区间的输与β-2微球蛋白也不尽相同[10]。因此，对于单独的B2MG分子是否足以评价血液透析患者中等量分子毒素清除率的充分性仍需要进一步研究证实。除了B2MG之外，其他中等量分子物质也许同样能在此方面发挥作用。

在研究组血液透析患者AOPP水平比对照组更高。已有报道称尿毒症患者，特别是血透患者AOPP水平将有显著升高[11]。本研究采取8周高通量血液透析治疗的患者血清AOPP水平没有发生改变。Bordoni等研究发现高通量血液透析患者的血浆羰基残基而非AOPP水平的显著降低[12]。他们还注意到：在低通量治疗的患者中两种标志物水平均无下降。高通量血液透析对AOPP水平缺乏影响，这可能与白蛋白及更高分子量的蛋白质发生损害导致AOPP分子量较大有关。

对于尿毒症患者，尤其是维持性血液透析的患者，其蛋白质可能发生包括羰基化在内的多种修饰。这导致蛋白质功能缺陷、晚期糖基化终末产物形成和细胞功能障碍[13]。本研究中，慢性血液透析患者PCO含量显著高于对照组。对于血液透析患者而言，尿毒症并不是导致羰基应激的唯一因素，血液透析治疗也可能对羰基平衡产生影响。血液透析期间，血液与透析膜接触后发生生化反应性和抗氧化物质的损失，可增加氧化应激而促进羰基形成。另一方面，血液透析可通过去除低分子量反应性羰基化合物来控制羰基过量。因此，蛋白质羰基水平是产生和清除平衡的结果。本研究中，血清蛋白质羰基水平在高通量血液透析期结束时显著减少，而在低通量血液透析期结束时显著增加。在低通量透析的情况下，有可能反应性羰基的产生超过透析膜对这些基团的清除能力。这可能导致蛋白质的羰基化，其分子量远远大于可以经低通量膜有效去除的范围。

总之，高通量血液透析时血清β-2微球蛋白和蛋白质羰基化显著减少，而晚期氧化蛋白产物却不受影响。另一方面，使用低通量膜的血液透析导致三种标记物的水平显著增加。因此高通量血液透析能改善对更广谱的尿毒症毒素的清除效率，这将改善慢性血液透析患者的生活质量并降低其发病率和死亡率。

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本文编辑：刘欣悦

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ISSN.2096-2479.2017.09.194.04

李霞