UroVysion荧光原位杂交技术在尿路上皮癌细胞学检测中常见问题分析

林兴滔，葛 岩，许 洁，王慧玲，骆新兰

UroVysion荧光原位杂交技术在尿路上皮癌细胞学检测中常见问题分析

林兴滔1，葛 岩1，许 洁1，王慧玲2，骆新兰1

尿路上皮癌；荧光原位杂交；尿液；脱落细胞

尿路上皮癌是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤[1]。近年来，尿路上皮癌的发病率呈逐年上升趋势，且易复发。尿细胞学检查及膀胱镜/输尿管镜检是诊断尿路上皮癌的常见手段。前者对低级别尿路上皮癌的敏感性偏低，且易受结石、炎症等因素的影响而出现假阳性结果；后者则为有创检查，费用昂贵且不易识别微小肿瘤[2-3]。遗传学研究表明尿路上皮癌易发生染色体畸变和染色体数目异常。其中3和17号染色体的多体性、7号染色体的三体性、9p21基因的杂合性缺失与尿路上皮癌的发生及复发显著相关[4]。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是通过用荧光标记的单链核苷酸探针，按碱基互补原则和细胞核内与之同源的DNA靶序列结合，在荧光显微镜下观察是否有染色体变异的技术，具有快速、简便、结果稳定、可重复性好、敏感性高、特异性强等优点，是当前辅助诊断众多肿瘤的重要方法[5-6]。目前，UroVysion FISH法已通过美国FDA批准上市用于临床检测尿液脱落细胞，是诊断尿路上皮肿瘤及评估复发的重要方法，在全国已广泛开展。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2008～2015年广东省人民医院存档的500例尿液脱落细胞学FISH样本。

1.2 试剂和仪器 美国Path Vysis公司UroVysion Bladder Cancer Recurrence Kit探针试剂盒，日本Olympus公司(型号BX51)荧光显微镜，美国ThermoBrite公司杂交仪(型号S50024)，水浴锅，电磁炉，温度计，无水乙醇。

1.3 方法 收集至少200 mL尿液标本(晨尿最佳)置于离心管中，1 500 r/min离心10 min。去上清，加入5 mL预热至37 ℃的0.075 mol/L KCl溶液，吹打悬浮细胞，37 ℃水浴温育30 min，期间吹打2～3次。于细胞低渗混合液中缓慢加入2 mL固定液，混匀，1 500 r/min离心10 min。去上清，加入5 mL固定液，混匀，静置10 min。离心去上清，根据细胞量加适量固定液，制成浓度适宜的细胞悬液，混匀后滴片。用吸管将细胞悬液吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻片上，自然晾干。室温下于2×SSC溶液中漂洗玻片2次，每次5 min。将玻片置于37 ℃胃蛋白酶工作液中浸泡5 min。于2×SSC溶液中漂洗玻片2次，每次5 min。然后将玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脱水，自然干燥。10 μL探针滴加于标本区域，切片封固后放入杂交仪75 ℃变性5 min，37 ℃杂交孵育过夜，去封片胶，放入2×SSC中泡掉盖玻片，置于72 ℃ 0.3%NP40/2×SSC洗2 min，自然晾干。加上DAPI于荧光显微镜下观察。

1.4 判读标准 在100倍镜下观察膀胱上皮脱落细胞的FISH结果并进行信号计数。正常细胞为2个红色信号，2个绿色信号，2个蓝色信号，2个金色信号(图1)。根据厂家提供的判读标准进行判读，标准如下：计数25个细胞，若出现以下两种情况，则为阳性：(1)若有4个以上细胞同时出现2个或者更多染色体扩增的情况(3、7或17)(图2)；(2)≥12个细胞内存在9p21缺失，则为阳性。如果一直为阴性，则应全片计数，直至出现4个以上细胞同时出现2个或者更多染色体扩增的情况(3、7或17)或≥12个细胞内9p21缺失，则可判读为阳性。若计数全片后，仍无上述结果，则为阴性。

①②

图1 UroVysion FISH阴性结果 图2 UroVysion FISH阳性结果

2 结果

500例尿液脱落细胞学FISH样本中有12例样本因细胞数量过少而无法判读，剩余有效病例为488例，阳性率为13.32%，阴性率为86.68%。

3 讨论

3.1 尿液标本DAPI染色一般情况分析 制片完成后，消化时应用DAPI染色由医师来判读，一方面了解细胞消化状态，一方面对细胞数量、组成成分、细胞分布及细胞形态有初步了解。如所观察的细胞学样本中尿路上皮细胞的数量如何、炎症细胞数量多少、是否存在细菌，如若存在炎症细胞，则应明确主要细胞成分是中性粒细胞、淋巴细胞还是单核细胞；尿样中细胞核比小淋巴细胞核大1.5～2倍，呈椭圆形或圆形的多为尿路上皮细胞核。同时还应注意尿路上皮细胞是散在分布还是成团分布；尿路上皮细胞形态是正常，还是具有异型性。上述观察对于后期FISH观察有重要的指导作用。3.2 FISH信号的一般判断 细胞学FISH观察顺序同组织学的FISH观察方法，首先在40倍镜下初步了解是否含有细菌、细胞分布是否均一、是否有局部成团的细胞，了解所观察玻片的一般情况后可转至100倍镜下进行下一步观察。

3.3 细胞数量的控制 细胞数量可影响观察的准确度。可适当控制所需进行FISH染色的滴片细胞数量，细胞数量过多或过少均会影响观察的准确度，特别是尿路上皮细胞数量过少，则需要重新收集尿液，否则容易漏诊[7]。对于多次采样细胞量均不足的样本，建议患者排尿前应用振动按摩器在下腹壁耻骨联合上方按摩膀胱20 min后留尿，或取灌洗液，可大大提高送检标本中尿路上皮细胞的数量。作者应用12孔的玻片，将3、10、30 μL梯度细胞悬液分别滴于第1、2、3孔，从而保证细胞数量。

3.4 混有其他细胞的处理 根据混有细胞种类的不同，处理方式不同：(1)若为女性患者，在样本收集过程中混入阴道分泌物，从而尿液细胞中可能混入子宫颈细胞。此种情况，在HE染色情况下可以区别，如混入细胞数量不多，则不会对结果造成影响；如混入细胞数量较多，在荧光显微镜下难以区分。且如果无法确定尿路上皮细胞来源将影响最终结果，有必要建议临床再次取材送检。(2)若为男性患者，则有可能混入精液，其内的精子在HE玻片中易于辨别：通常细胞形态较小，一端稍尖，另一端带有鞭毛。在荧光显微镜下，这些基本形态依稀可辨，所以对最终结果无影响。(3)含大量白细胞的尿液，此种情况下，炎症细胞数量占多数，而尿路上皮细胞数量少。一般而言，如为急性感染，则尿液中主要的炎症细胞为中性粒细胞，细胞核多呈分叶状，此种情况易与尿路上皮细胞相辨别。如果为慢性感染，则主要炎症细胞为淋巴细胞和浆细胞，因经过FISH消化、洗涤处理后，炎细胞肿胀不易与尿路上皮细胞相鉴别，此种情况下，FISH检测容易出现假阴性结果。处理方法：如混入的淋巴细胞数量较少，同时尿路上皮细胞数量相对较多且在DAPI通道下难以区分时，一般可在白光下根据细胞胞质的量来确定，淋巴细胞胞质少，而尿路上皮细胞胞质较多，借此加以区分。如混入的淋巴细胞数量较多，同时尿路上皮细胞也较少且在DAPI通道下难以区分时，一般建议经临床积极抗炎治疗后，复查尿液脱落细胞FISH结果。一般经过抗炎之后，尿液中白细胞数量明显减少，而尿路上皮细胞数相对增加，此时FISH结果均有较高的可信性及可重复性。在临床工作中，部分患者经抗炎治疗后，复查FISH结果，FISH为阴性者，多为复杂尿路感染，如尿路结石，而FISH结果阳性者多为尿路上皮肿瘤所致的尿路感染，两者在临床上均可表现为肉眼血尿。

3.5 结果判读 细胞重叠、破损、未去除细胞质的细胞核不计数，微弱杂交信号不计数，细胞内杂交信号互相靠近者计为1个信号。一般来说，如果阳性细胞数很高或很低，判读均无疑。但是对刚好处于阈值的病例而言，则很难判读阴阳性，此时，应由另外一名医师进行重复计数。

FISH用于尿路上皮癌的诊断具有特异性高、敏感性强的特点，但是由于收集的细胞来源于晨尿中的脱落细胞，细胞来源有一定的随机性，因而有一定的漏诊情况发生，故应对临床强调对于FISH检测的患者最好连送3次样本以减低漏诊的可能。其次，在分子报告中，如果结果为阴性，一般要求观察计数全片的尿路上皮细胞，如在此过程中，观察计数不仔细或方法不得当，仍有一部分漏诊可能发生。如何有效的观察计数，以更大限度的控制漏诊的可能则是分子病理医师在日常工作中迫切需要解决的问题。

总之，尿液脱落上皮细胞FISH检测是诊断尿路上皮癌或术后复查的重要方法，而准确的判读则为该方法的有效性提供了保证。然而，目前针对尿液脱落上皮细胞的FISH检测尚未有规范化的操作程序或标准化的结果判读，而病理医师在日常工作中也经常会遇到复杂的情况。因此，作者总结了近几年来UroVysion FISH检测中遇到的常见问题供大家参考和讨论，旨在进一步提高FISH在尿液脱落细胞中检测的可重复性和准确性，以提高其在尿路上皮癌中的早期诊断率及协助术后复发诊断率。

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广东省医学科学技术研究项目(A2016284)、广东省医学科学技术研究项目(A2015048)、广东省中医药局科研项目(20161006)

1广东省人民医院(广东省医学科学院)病理医学部病理科，广州 5100802广东省人民医院广东省医学科学院普通外科，广州 510080

林兴滔，男，主管技师。E-mail: lingxingtao@126.com 骆新兰，女，主任技师，通讯作者。E-mail: lanx_luo@126.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.028.html

R 737

B

1001-7399(2017)08-0933-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.028

接受日期：2017-03-29