食管胃结合部腺癌中CHK1蛋白的表达及意义

闫静波，卫 茹

·短篇论著·

食管胃结合部腺癌中CHK1蛋白的表达及意义

闫静波1，卫 茹2

目的 探讨CHK1蛋白在食管胃结合部腺癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化和Western blot法检测141例正常胃黏膜、112例胃黏膜上皮内瘤变及141例食管胃结合部腺癌中CHK1蛋白的表达，并分析其与食管胃结合部腺癌临床病理征特的关系。结果 从正常胃黏膜组→低级别上皮内瘤变组→高级别上皮内瘤变组→食管胃结合部腺癌组，免疫组化及Western blot检测结果显示CHK1蛋白表达分别为9.22%、22.73%、48.53%、79.43%及1、2.40±0.11、5.39±0.37、9.01±1.52，CHK1蛋白表达逐渐上升(P<0.05)。在食管胃结合部腺癌中，CHK1蛋白表达与食管胃结合部腺癌病理分化程度及Lauren分型相关(P<0.05)。结论 CHK1蛋白在食管胃结合部腺癌发生、发展中起重要作用。

食管肿瘤；食管胃结合部腺癌；上皮内瘤变；CHK1；Western blot

细胞周期紊乱可引起基因组的不稳定，这与肿瘤的关系密切[1]。细胞周期检验点激酶1(checkpoint kinase 1, CHK1)是细胞检验点的转导因子，CHK1在多种肿瘤细胞中高表达，与肿瘤的发生发展、侵袭转移、抗肿瘤细胞凋亡、肿瘤耐药性等方面密切相关[2]。CHK1能对放疗化疗所导致的肿瘤细胞DNA损伤进行修复，CHK1高表达容易造成肿瘤对放、化疗耐药[3]。目前CHK1已成为肿瘤研究的潜在靶点之一。近年来食管胃结合部腺癌发病率明显上升，肿瘤中心位于胃食管交界(esophagogastric junction, EGJ)及上下各5 cm范围内的腺癌即为食管胃结合部腺癌，食管胃结合部腺癌最常用的分型是Siewert分型：SiewertⅠ型，肿瘤中心位于EGJ上1～5 cm处，即下段食管癌；SiewertⅡ型，肿瘤中心位于EGJ上1 cm至下2 cm范围，即贲门癌；SiewertⅢ型，肿瘤位于EGJ下2～5 cm范围，即贲门下癌[4]。Siewert三种类型，Ⅱ、Ⅲ型相对较多见，Ⅰ型相对较少见[5]。本实验采用免疫组化法和Western blot法检测CHK1蛋白在食管胃结合部腺癌标本的表达，对CHK1蛋白在食管胃结合部腺癌的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2005年～2015年10年内河北医科大学附属邢台市人民医院病理科存档的食管胃结合部腺癌标本141例，并且经过一位病理副主任医师诊断，一位病理主任医师审核。

1.2 研究分组 食管胃结合部腺癌组141例，胃黏膜上皮内瘤变组112例，正常胃黏膜组141例。各组情况如下：食管胃结合部腺癌组标本共141例，术前均无放、化疗：患者男性93例，女性48例；年龄<50岁者56例，≥50岁者85例；肿瘤最大直径<4 cm 78例，≥4 cm 63例；组织学分化：高分化50例，中+低分化91例；Lauren分型：肠型85例，弥漫型56例；癌组织侵犯黏膜层或黏膜下层(早期胃癌)32例，侵及肌层或浆膜层(中晚期胃癌)109例；无淋巴结转移者81例，有淋巴结转移者60例；SiewertⅠ型6例，SiewertⅡ型71例，SiewertⅢ型64例。胃黏膜上皮内瘤变组112例，其中低级别上皮内瘤变44例，高级别上皮内瘤变68例。正常胃黏膜组141例，取自胃癌标本距肿物5 cm远的胃黏膜。以上三大组标本，均分为两份：一份经10%中性福尔马林固定，以备HE和免疫组化染色；另一份放入液氮冻存，以备Western blot检测。

1.3 免疫组化 采用免疫组化EnVision两步法进行CHK1染色。CHK1蛋白在胞质和胞核表达。(1)按着色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)按阳性细胞数评分：阳性细胞数<10%为0分，10%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。将两项得分结果相乘：≥2分为(+)，0～1分为(-)。

1.4 Western blot检测 对各研究组的蛋白进行提取，参照蛋白标准曲线测定蛋白的含量，做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶内的样品蛋白转移至硝酸纤维膜上，5%BSA常温振荡封闭1 h。一抗(CHK1抗体)4 ℃过夜，二抗室温1 h。然后加入碱性磷酸酶显色剂显色20 min。用扫描仪扫描NC膜上蛋白表达条带灰度，用自动图像分析系统进行定量分析，正常胃黏膜组的平均光密度值(OD值)取值为1，其它各组与正常胃黏膜组相比取值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，先做总的χ2检验，然后进行两两χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。采用Kaplan-Meier分析CHK1蛋白表达与食管胃结合部腺癌生存期的关系。采用Log-rank单因素分析临床病理特征与食管胃结合部腺癌生存期的关系。

2 结果

2.1 免疫组化检测CHK1的表达 免疫组化结果显示：从正常胃黏膜组→低级别上皮内瘤变组→高级别上皮内瘤变组→食管胃结合部腺癌组，CHK1蛋白表达逐渐上升(P<0.05，表1，图1)。

表1 免疫组化法检测正常胃黏膜组、上皮内瘤变组、 食管胃结合部腺癌组中CHK1的表达

2.2 Western blot法检测CHK1的表达 Western blot结果显示：从正常胃黏膜组→低级别上皮内瘤变组→高级别上皮内瘤变组→食管胃结合部腺癌组，CHK1蛋白表达逐渐上升(表2，图2)。

表2 Western blot法检测正常胃黏膜组、上皮内瘤变组、 食管胃结合部腺癌组中CHK1的表达

图2 Western blot法检测CHK1蛋白表达

1.正常胃黏膜组；2.低级别上皮内瘤变组；3.高级别上皮内瘤变组；4.食管胃结合部腺癌组

2.3 CHK1表达与食管胃结合部腺癌临床病理特征的关系 统计分析显示，CHK1表达与食管胃结合部腺癌病理分化程度及Lauren分型相关(P<0.05)，CHK1蛋白在中+低分化胃腺癌的表达强于高分化胃腺癌；Lauren分型中，CHK1蛋白在弥漫型胃腺癌中的表达强于肠型胃腺癌(表3)。

表3 CHK1表达与食管胃结合部腺癌临床病理特征的关系

临床病理参数nCHK1阳性阴性阳性率(%)χ2值P值性别 男93712276．341．5950．207 女4841785．42年龄(岁) <5056461082．140．4180．518 ≥5085661977．65肿瘤直径(cm) <478631580．770．1910．662 ≥463491477．78分化程度 高50341668．006．1980．013 中+低91781385．71Lauren分型 肠型85612471．767．7020．006 弥漫型5651591．07侵犯深度 早期3224875．000．4980．480 中晚109882180．73淋巴结转移 无81602174．073．3460．067 有6052886．67Siewert分型 Ⅰ65183．33 Ⅱ71561578．870．0140．907 Ⅲ64511379．69

3 讨论

近年胃窦癌发病率逐年下降；相反，食管胃结合部癌的发病率持续上升，食管胃结合部腺癌的进展较快，预后较差，约80%的食管胃结合部腺癌发现时已经晚期，其5年生存率常低于30%[6]。与胃窦癌相比，食管胃结合部腺癌较早深层胃壁浸润、转移复发[7-8]。食管胃结合部腺癌最常用的分型为Siewer分型，SiewertⅢ型预后最差，SiewertⅡ型次之，SiewertⅠ型预后最好。在西方国家，这三型的发病率基本相同；在我国，SiewertⅠ少见，而SiewertⅡ和Ⅲ多见。肖文光等[9]的研究结果显示，我国SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分别占3.9%、53.1%、43.0%；杨宏等[10]的研究结果显示，我国SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分别占4.7%、50.3%、45.0%。本组141例食管胃结合部腺癌中SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分别为6例、71例、64例，所占比例分别为4.3%、50.3%、45.4%，结果与文献报道基本一致。

ABC

图1 CHK1在正常胃黏膜组(A)、上皮内瘤变组(B)和食管胃结合部腺癌组(C)中的表达，EnVision两步法

调控细胞周期是一个复杂的过程，细胞周期检查点和其蛋白控制着细胞周期，细胞周期检测点蛋白质缺失会引起细胞周期的紊乱，其紊乱造成基因组不稳定，这与肿瘤关系密切[1]。研究细胞周期的调控能够为探索肿瘤发生、发展和肿瘤放、化疗的耐药性提供思路。CHK1是一种细胞检验点转导因子，多数研究结果显示在多种肿瘤细胞中CHK1高表达，其在肿瘤的发生发展、侵袭转移、肿瘤耐药性等方面发挥作用[2]，CHK1异常表达会造成细胞周期检测点对DNA损伤失去修复作用，增加机体肿瘤易感性，引起肿瘤发生。目前，CHK1已成为肿瘤耐药性研究的潜在靶点之一，因为CHK1能够修复放疗化疗引起的瘤细胞DNA损伤，CHK1其表达水平不但与肿瘤的进展有关，而且与放、化疗的效果关系密切，CHK1高表达容易造成肿瘤对放、化疗耐药[3]。

本实验免疫组化和Western blot检测结果显示，从正常胃黏膜组→低级别上皮内瘤变组→高级别上皮内瘤变组→食管胃结合部腺癌组，CHK1蛋白表达逐渐上升(P<0.05)。结果显示，从正常胃黏膜→低级别上皮内瘤变→高级别上皮内瘤变→高分化腺癌→低分化腺癌，CHK1蛋白表达逐渐上升，结果说明CHK1蛋白可能在食管胃结合部黏膜的癌变及其发生、发展中起重要作用。

分析CHK1蛋白与食管胃结合部腺癌临床病理因素的关系发现，CHK1表达与患者年龄、性别、侵犯深度、肿瘤大小、Siewert分型及有无淋巴结转移无关(P>0.05)；然而，CHK1蛋白表达与食管胃结合部腺癌的病理分化程度和Lauren分型相关(P<0.05)。CHK1蛋白在中+低分化胃腺癌的表达强于高分化胃腺癌；Lauren分型中，CHK1蛋白在弥漫型胃腺癌的表达强于肠型胃腺癌；这说明CHK1可能与食管胃结合部腺癌的恶性程度及发生、发展有一定的关系，其可能是判断肿瘤恶性程度高低及分级的重要标志。随着肿瘤的进展，恶性程度的增高，CHK1蛋白表达升高，提示CHK1蛋白可能促进食管胃结合部腺癌的发生、发展。Lauren分型弥漫型胃腺癌CHK1蛋白表达高于肠型胃腺癌，弥漫型胃腺癌主要包括低分化腺癌及印戒细胞癌，恶性程度相对较高，预后较差，而肠型胃腺癌主要指高分化腺癌，恶性程度相对较低，预后较好，仍然提示CHK1蛋白在低分化食管胃结合部腺癌中表达高，CHK1蛋白在肿瘤的发生、发展中可能起重要作用，如果患者CHK1蛋白升高，那么预后较差。

本组实验中CHK1蛋白在有淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组，CHK1蛋白可能促进食管胃结合部腺癌的淋巴结转移，有淋巴结转移的患者预后较差，但差异无统计学意义(P>0.05)。

目前，CHK1已成为肿瘤潜在的治疗靶点。放、化疗能够造成肿瘤细胞DNA的损伤，CHK1蛋白能够对这种DNA损伤进行修复。肿瘤细胞能够利用活化的G2/M期检测点，延长此期的阻滞，使受损的DNA进行修复，这样就会引起肿瘤对放化疗耐药[11]。如果肿瘤细胞内CHK1蛋白升高，肿瘤细胞对化疗药物和电离辐射敏感的敏感性降低，肿瘤治疗效果欠佳[12]。因此，采用RNA干扰技术，抑制CHK1的表达，消除放化疗引起DNA损伤后诱导的G2期阻滞，抑制G2/M期的检测点，会增加肿瘤细胞凋亡，提高肿瘤细胞对药物和放射线的敏感性，消除肿瘤细胞的耐药性[3]。

综上所述，从正常胃黏膜→低级别上皮内瘤变→高级别上皮内瘤变→高分化腺癌→低分化腺癌，CHK1蛋白表达逐渐上升。CHK1蛋白表达与食管胃结合部腺癌的病理分化程度、Lauren分型有关，作者推测CHK1蛋白促进食管胃结合部腺癌的发生、发展及患者预后。深入研究CHK1蛋白在食管胃结合部腺癌的表达及其机制，会给治疗食管胃结合部腺癌寻找新的有效途径。

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闫静波，男，硕士，副主任医师。E-mail: yanjingbo2012@163.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.017.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)08-0907-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.017

接受日期：2017-05-09