DAPPER1对食管鳞状细胞癌细胞恶性生物学行为的影响及其表观遗传学调节机制

郭艳丽，邝 钢，周 珍，董稚明，郭 炜，沈素朋，梁 佳，郭 鑫

·论 著·

DAPPER1对食管鳞状细胞癌细胞恶性生物学行为的影响及其表观遗传学调节机制

郭艳丽，邝 钢，周 珍，董稚明，郭 炜，沈素朋，梁 佳，郭 鑫

目的 检测DAPPER1蛋白对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)细胞株恶性生物学行为的影响，并进一步分析ESCC组织中DAPPER1蛋白表达及引起其表达异常的可能机制。方法 应用MTT、克隆形成、划痕修复实验检测DAPPER1对ESCC细胞株恶性生物学行为的影响；应用RT-PCR及甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)技术检测细胞株(TE13、T.Tn、Eca109)中DAPPER1 mRNA的表达及其启动子区甲基化状态；应用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)法检测ESCC组织中DAPPER1蛋白的表达。结果 DAPPER1在3株细胞中呈弱表达或阴性，应用甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-Dc)处理细胞后，其表达强度在各细胞株中均有不同程度的增加；同时，DAPPER1过表达及5-Aza-Dc处理可明显抑制TE13细胞的增殖及迁移能力；而应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin A(TSA)处理细胞株后，DAPPER1在各细胞株中的表达无明显改变；DAPPER1蛋白在ESCC组织中的表达较癌旁组织明显下调(P<0.01)，且其表达与该基因启动子区域异常甲基化状态有关(P<0.01)。结论 ESCC中DAPPER1主要起抑癌基因作用，并且该基因启动子区域的异常高甲基化可能是引起其表达下调的主要机制之一。

食管肿瘤；甲基化；增殖；迁移；DAPPER1

Wnt/β-catenin信号转导通路参与细胞的增殖、分化等多种生命过程，研究表明该通路的异常活化与多种肿瘤的发生、发展相关，包括食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)[1]。因此，有关该通路关键因子功能的研究对于明确ESCC的发病机制具有重要意义。研究指出DAPPER1在多种肿瘤中的表达水平低于正常对照组织并具有抑制肿瘤细胞生长和转移的能力，被认为是Wnt通路的抑制因子之一[2]。但其在ESCC中的作用及其表达情况仍未见相关报道。本实验通过分析DAPPER1蛋白对ESCC细胞株恶性生物学行为的影响及ESCC组织中DAPPER1的表达及其甲基化状态，探讨DAPPER1在ESCC中的可能作用及引起其表达调控异常的可能机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2005年～2009年河北医科大学第四医院胸外科诊治的ESCC患者159例。其中男性93例，女性66例，平均年龄57.9岁(36～79岁)。患者术前均未行放、化疗。每例患者均取癌组织原发灶及距癌组织2～5 cm处的癌旁组织，手术切除标本一部分保存在-80 ℃低温冰箱用于提取DNA及RNA，另一部分进行石蜡包埋，常规HE染色，经病理医师诊断证实癌组织均为ESCC，癌旁组织均为正常黏膜组织或增生的黏膜组织。肿瘤患者临床分期根据美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)及国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control, UICC)标准；肿瘤病理分级根据WHO标准；上消化道肿瘤(upper gastrointestinal cancers, UGIC)家族史阳性定义为家族中有一名以上一级亲属和(或)两名以上二级亲属患食管癌/贲门癌/胃癌者。本实验经医院伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂 实验用的5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-Dc)、曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)、噻唑蓝(MTT)均购自美国Sigma公司；FuGENE HD转染试剂盒购自瑞士Roche公司；亚硫酸氢盐转化试剂盒(Epitect Fast Bisulfite Conversion Kits)购自德国Qiagen公司；甲基转移酶(M.SssI)购自北京美科美生物公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒(Reverse Transcription System A3500)购自Promega北京生物公司；本实验所用全部引物均由北京赛百胜基因公司合成。兔抗人多克隆抗体DAPPER1(1 μg/mL，ab72078)购自英国Abcam公司；ECL发光试剂购自碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及药物处理 常规培养TE13、T.Tn、Eca109细胞株，待细胞密度较低且处于对数生长期时，分别用5 μmol/L的5-Aza-Dc处理72 h或0.3 μmol/L TSA处理24 h，期间每24 h更换1次培养液，处理完毕后更换为完全培养基继续培养，24 h后收集细胞，提取DNA及RNA，进行后续检测。药物剂量及处理时间依据先前文献报道[3-5]。未经药物处理的细胞作为对照组。

1.3.2 建立DAPPER1过表达的稳转细胞株 将含人全长DAPPER1基因的pcDNA3.1质粒和空载体质粒分别转染至低表达DAPPER1的人ESCC细胞株TE13中，经G418抗性筛选，得到过表达DAPPER1的稳转细胞株DAPPER1/TE13及对照组细胞株pcDNA3.1/TE13。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖能力 将对数生长期的DAPPER1/TE13及pcDNA3.1/TE13细胞以及5-Aza-Dc处理72 h后TE13细胞分别消化并接种于96孔板，测定各孔吸光度值，检测细胞的增殖能力。

1.3.4 平板克隆形成实验检测细胞贴壁克隆生长的能力 选取生长状态良好的对数生长期TE13细胞、DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc处理72 h后TE13细胞，将细胞消化吹打为单细胞混悬液，接种于35 mm培养皿(500个细胞/皿)。完全培养基培养，待有克隆长出，苏木精染色，镜下观察，并计算各组细胞的克隆形成率。

1.3.5 划痕修复实验检测细胞的迁移能力 将对数生长期的两组TE13细胞及一组过表达DAPPER1的DAPPER1/TE13细胞分别消化并接种于24孔板，其中一组TE13细胞株用5-Aza-Dc处理72 h，分别用10 μL移液器吸头垂直于孔底划一条直线，镜下观察不同时间点划痕愈合情况。初始划痕宽度定义为1。

1.3.6 甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)技术检测DAPPER1基因的甲基化状态 采用酚/氯仿抽提法，提取细胞株及组织标本中的DNA，分光光度计进行定量后，取适量DNA按照亚硫酸氢盐转化试剂盒说明书将DNA变性及纯化。MSP引物序列：上游 5′-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3′，下游 5′-AAACGCTAAAACTACGACCGCG-3′，产物长度121 bp。用经甲基化酶(Sss I)处理后的基因组DNA作为甲基化的阳性对照，用无消化系统肿瘤及其它系统肿瘤的正常人外周血DNA作为非甲基化的阳性对照，阴性对照则用灭菌双蒸水取代DNA模板进行PCR。另随机选取10%标本进行重复实验以验证结果的可靠性。

1.3.7 RT-PCR技术检测DAPPER1基因mRNA的表达 按Trizol试剂说明书提取细胞株中总RNA，并参照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA。用于检测DAPPER1基因mRNA的表达。引物序列：上游5′-CACAAGCGAACTGACTACCG-3′，下游5′-GTAATTGCTCTGCTCGTCCT-3′，片段大小237 bp。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，GAPDH作为内参照。利用图像分析系统Gel work-2ID对mRNA进行定量。

1.3.8 免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)法检测DAPPER1蛋白的表达 应用常规SP法。石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇水化。3%甲醇过氧化氢封闭后用EDTA高压修复2 min，血清封闭，一抗孵育过夜，再依次加入二抗和三抗，DAB显色，苏木精复染。以PBS代替一抗做空白对照。阳性染色定位于细胞质。以传统的染色强度与着色面积双评分的方法对结果进行判定[6]。每张切片随机选择5个不重复的高倍视野(×400)，根据染色深浅和着色细胞所占百分比进行评分。(1)按细胞染色强度评分：无阳性染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)按着色百分比评分：阳性细胞数<25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，≥75%为3分。将两项得分结果相加：0～2分为阴性，3～6分为阳性。

2 结果

2.1 ESCC细胞株中启动子区甲基化及组蛋白乙酰化对DAPPER1基因表达的影响 为明确表观遗传学的两大机制(甲基化及组蛋白乙酰化)是否对DAPPER1基因的表达有影响，此次实验分别应用5-Aza-Dc及TSA处理细胞株。结果显示，DAPPER1基因在3株细胞株中均呈弱阳性或阴性，应用5-Aza-Dc处理后，其mRNA表达增强或恢复为阳性；而应用TSA处理细胞后，DAPPER1基因在3株细胞株中的表达无明显变化。同时，MSP结果显示，5-Aza-Dc处理前，3株细胞株均可检测出较强的甲基化条带，处理后，甲基化条带减弱或消失，而非甲基化条带出现或增强(图1)。

图1 5-Aza-Dc及TSA处理对DAPPER1 mRNA表达及 基因甲基化状态的影响

M.甲基化基因；U.非甲基化基因；GAPDH为内参基因

2.2 DAPPER1基因对ESCC细胞恶性生物学行为的影响

2.2.1 DAPPER1过表达及5-Aza-Dc处理对TE13细胞增殖能力的影响 利用MTT实验检测DAPPER1基因过表达及5-Aza-Dc处理对TE13细胞增殖能力的影响。结果显示，TE13、pcDNA3.1/TE13、DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc处理细胞株其增殖指数分别为0.894±0.016、0.886±0.019、0.394±0.029、0.480±0.028，与未经处理的TE13细胞株及转入空载体的pcDNA3.1/TE13相比，DAPPER1基因过表达细胞株及5-Aza-Dc处理可使细胞的增殖指数明显下降(P<0.01，图2)。

图2 MTT法检测DAPPER1基因对TE13细胞增殖能力的影响**P<0.01，##P<0.01

2.2.2 DAPPER1过表达及5-Aza-Dc处理对TE13细胞贴壁克隆生长的变化 应用平板克隆形成实验检测DAPPER1过表达及5-Aza-Dc处理对TE13细胞贴壁克隆生长的变化。结果显示：过表达DAPPER1及5-Aza-Dc处理后的TE13细胞均较野生型TE13细胞克隆形成能力减弱[(29.600±6.974)%vs(61.867±10.086)%；(15.867±3.443)%vs(61.867±10.086)%]，且差异有统计学意义(t过表达=16.288，P=0.004；t处理=11.218，P=0.008；图3)。

图3 平板克隆形成实验检测DAPPER1对TE13细胞 贴壁生长能力的影响 **P<0.01

2.2.3 DAPPER1过表达及5-Aza-Dc处理对TE13细胞迁移能力的影响 应用划痕修复实验检测DAPPER1基因过表达及5-Aza-Dc处理对TE13细胞迁移能力的影响。过表达DAPPER1的DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc处理后的TE13细胞在12 h、24 h、36 h、48 h各时间点的划痕相对宽度值见表1，DAPPER1过表达以及5-Aza-Dc处理使TE13细胞在各时间点的迁移率均低于未经处理的TE13，且差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 过表达DAPPER1及5-Aza-Dc处理后的TE13 细胞在不同时间点的相对划痕宽度±s，n=3)

#P<0.05；*P<0.05

2.3 ESCC组织中DAPPER1蛋白表达及其与临床病理特征的关系 ESCC组织中DAPPER1蛋白阳性率为59.1%(94/159)，明显低于对应的癌旁非肿瘤组织(79.2%，126/159)，且差异有统计学意义(χ2=15.104，P<0.001)。DAPPER1蛋白阳性率在有淋巴结转移组、临床分期为Ⅲ+Ⅳ期患者中明显高于无淋巴结转移组及临床分期为Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05)，而该蛋白表达与ESCC患者年龄、性别、肿瘤组织的病理分级及上消化道肿瘤家族史均无关(P>0.05，表2)。

表2 食管鳞状细胞癌中DAPPER1蛋白表达与 临床病理特征的关系

2.4 ESCC组织中DAPPER1蛋白表达与该基因启动子区甲基化状态的关系 在94例DAPPER1蛋白阳性的ESCC组织中，基因启动子区存在高甲基化现象者23例，甲基化频率(24.5%)明显低于DAPPER1蛋白阴性的ESCC组织；ESCC组织中DAPPER1蛋白表达与其甲基化状态有关(表3)。

表3 食管鳞状细胞癌中DAPPER1蛋白表达与其 基因甲基化状态的关系

M.甲基化；U.非甲基化

3 讨论

DAPPER家族是在以爪蟾为模型研究神经管的分化时，运用酵母双杂交筛选发现的可与Dishevelled相互作用的抑制因子[7]。DAPPER1是该家族的成员之一，研究发现DAPPER1与多条信号转导通路，尤其是Wnt通路的关系极为密切，并可通过对信号分子的调控参与肿瘤的发生、发展[8-10]。

DAPPER1基因定位于人类染色体14q23.1区域，在多种恶性肿瘤中均报道有该区域的缺失或断裂，因此认为在染色体的该区域可能存在肿瘤抑制基因[11]。研究发现，在肝细胞癌[12]、胃癌[8]、肺癌[13]等多种恶性肿瘤中DAPPER1的表达低于正常组织，提示其抑癌基因的作用，并且在对肺癌[13]的研究中发现DAPPER1低表达者预后较差。同时研究指出DNA启动子甲基化可能是导致DAPPER1表达下调的表观遗传学机制之一[14]。但有关DAPPER1在ESCC中的表达及其发挥的生物学功能仍未见报道。本组实验发现，ESCC组织中DAPPER1蛋白表达明显低于对应癌旁非肿瘤组织，与先前的研究报道一致。提示DAPPER1蛋白在ESCC中可能发挥抑癌基因作用。

为进一步明确DAPPER1在ESCC中发挥的作用及引起其表达异常的可能机制。研究者首先检测了3株ESCC细胞株中DAPPER1基因mRNA的表达，发现均为阴性或弱表达。应用5-Aza-Dc进行处理，该药物可通过降低DNA甲基化酶的活性而重新开启因高甲基化而沉默的基因。结果显示处理后3株ESCC细胞系DAPPER1表达均明显升高；同时MSP结果显示，5-Aza-Dc处理后该基因的甲基化条带减弱或消失，而非甲基化条带则明显增强；两结果共同提示ESCC中DAPPER1基因的高甲基化水平可能是引起其表达下调的机制之一。对ESCC组织标本的检测发现，癌组织中DAPPER1基因的高甲基化现象明显高于癌旁非肿瘤组织，且与DAPPER1蛋白表达缺失相关，进一步提示在ESCC组织标本中DAPPER1基因存在甲基化失活现象。组蛋白乙酞化是表观遗传修饰的另一主要方面。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可通过抑制组蛋白的去乙酰化而调节基因的表达。本实验应用TSA处理细胞，发现DAPPER1表达在处理前后无明显改变，初步判定组蛋白的乙酰化对该基因的表达无明显影响。同时，本组实验应用MTT、克隆形成以及划痕修复实验分别检测了DAPPER1对TE13恶性生物学行为的影响。结果显示，5-Aza-Dc处理及DAPPER1过表达可明显抑制TE13细胞的增殖及迁移能力。Yin等[9]在对乳腺癌的研究中也同样发现该基因在体内及体外可通过诱导细胞凋亡而抑制细胞的增殖，并可通过拮抗Wnt/β-catenin信号转导通路而抑制细胞的迁移，与本实验结果相符。在对肺癌[13]的研究中也同样发现抑制DAPPER1表达可以激活Wnt/β-catenin信号通路增强肺癌细胞的增殖和侵袭能力。

综上所述，DAPPER1可抑制ESCC细胞的增殖及迁移能力，并在ESCC组织标本中的表达量明显低于癌旁非肿瘤组织，提示了其在ESCC中的抑癌基因作用；并且基因启动子区的高甲基化可能是引起其表达下调的主要表观遗传学机制之一。

[1] 郭艳丽, 王馥丽, 郭 炜, 等. 贲门腺癌中SFRP1、DKK3基因启动子区甲基化状态的联合分析[J]. 临床与实验病理学杂志, 2010,26(2):154-157.

[2] Katoh M. Identification and characterization of human DAPPER1 and DAPPER2 genes in silico[J]. Int J Oncol, 2003,22(4):907-913.

[3] Meng C F, Zhu X J, Peng G,etal. Re-expression of methylation-induced tumor suppressor gene silencing is associated with the state of histone modification in gastric cancer cell lines[J]. World J Gastroenterol, 2007,13(46):6166-6171.

[4] Kondo Y, Shen L, Issa J P. Critical role of histone methylation in tumor suppressor gene silencing in colorectal cancer[J]. Mol Cell Biol, 2003,23(1):206-215.

[5] Guo W, Cui L, Wang C,etal. Decreased expression of RASSF1A and upregulation of RASSF1C is associated with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clin Exp Metastasis, 2014,31(5):521-533.

[6] Umemoto M, Yokoyama Y, Sato S,etal. Carbonyl reductase as a significant predictor of survival and lymph node metastasis in epithelial ovarian cancer[J]. Br J Cancer, 2001,85(7):1032-1036.

[7] Kivimäe S, Yang X Y, Cheyette B N. All Dact (Dapper/Frodo) scaffold proteins dimerize and exhibit conserved interactions with Vangl, Dvl, and serine/threonine kinases[J]. BMC Biochem, 2011,30:12-33.

[8] Wang S, Kang W, Go M Y,etal. Dapper homolog 1 is a novel tumor suppressor in gastric cancer through inhibiting the nuclear factor-κB signaling pathway[J]. Mol Med, 2012,18(20):1402-1411.

[9] Yin X, Xiang T, Li L,etal. DACT1, an antagonist to Wnt/β-catenin signaling, suppresses tumor cell growth and is frequently silenced in breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2013,15(2):R23.

[10] Hou J, Wen Y H, Feng K N,etal. DACT1 is involved in human placenta development by promoting Wnt signaling[J]. Arch Gynecol Obstet, 2015,291(6):1289-1296.

[11] Astolfi A, Nannini M, Pantaleo M A,etal. A molecular portrait of gastrointestinal stromal tumors: an integrative analysis of gene expression profiling and high-resolution genomic copy number[J]. Lab Invest, 2010,90(9):1285-1294.

[12] Yau T O, Chan C Y, Chan K L,etal. HDPR1, a novel inhibitor of the WNT/β-catenin signaling, is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma: involvement of methylation-mediated gene silencing[J]. Oncogene, 2005,24(9):1607-1614.

[13] Yang Z Q, Zhao Y, Liu Y,etal. Downregulation of hdpr1 is associated with poor prognosis and affects expression levels of p120-catenin and beta-catenin in nonsmall cell lung cancer[J]. Mol Carcinog, 2010,49(5):508-519.

[14] Deng J, Liang H, Zhang R,etal. Methylated CpG site count of dapper homolog 1 (DACT1) promoter prediction the poor survival of gastric cancer[J]. Am J Cancer Res, 2014,4(5):518-527.

Effect of DAPPER1 on malignant biological behavior ofesophageal carcinoma cells and its epigenetic regulatory mechanism

GUO Yan-li, KUANG Gang, ZHOU Zhen, DONG Zhi-ming , GUO Wei, SHEN Su-peng, LIANG Jia, GUO Xin

(DepartmentofPathology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,HebeiCancerInstitute,Shijiazhuang050011,China)

Purpose To investigate the effect of DAPPER1 on the malignant biological behavior in esophageal carcinoma cells, and further to analyze the expression and the possible regulated mechanism of DAPPER1 in esophageal squamous cell cancer (ESCC) samples. Methods MTT assay, colony formation assay and wound healing were used to examine the effect of DAPPER1 on malignant biological behavior in esophageal carcinoma cells, RT-PCR and MSP methods were applied respectively to examine the expression and the methylation status of DAPPER1 in three ESCC cell lines (TE13, T.Tn, Eca109). Immunohistochemistry was used to examine the DAPPER1 protein expression. Results The negative or weak expression of DAPPER1 was detected in ESCC cell lines. After treated with 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC, a demethylation agent), the expression level of DAPPER1 was obviously increased. Meanwhile, over expression of DAPPER1 or treated with 5-Aza-Dc could obviously inhibit proliferation and immigration abilities of TE13 cell line. The level of DAPPER1 expression had no obviously change after treated with trichostatin A (TSA). Decreased protein expression of DAPPER1 was observed in ESCC tumor tissues compared with non-cancerous tissues (P<0.01), and associated with the methylation status of this gene (P<0.01). Conclusion DAPPER1 plays an important role of tumor suppressor gene in esophageal carcinoma, and the aberrant hypermethylation may be one of the main mechanisms in abnormal expression of this gene.

esophageal neoplasms; methylation; proliferation; immigration; DAPPER1

国家自然科学基金(81472335)、河北省医学科学研究重点课题计划项目(20170698)

河北医科大学第四医院河北省肿瘤研究所病理研究室，石家庄 050011

郭艳丽，女，博士，副主任医师。E-mail: yanli800224@163.com 郭 炜，女，博士，主任医师，通讯作者。E-mail: guowei7303@163.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.001.html

R 735.1

A

1001-7399(2017)08-0827-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.001

接受日期：2017-05-16