阿托伐他汀对哮喘大鼠气道炎症、重塑及血清学相关炎症指标的影响

潘文森，肖冉冉，关继涛，李爱民，杨红申

(1.河北医科大学第二医院呼吸二科，河北 石家庄 050000;2.河北医科大学第二医院呼吸一科，河北 石家庄 050000;3.河北医科大学第二医院生殖医学科，河北 石家庄 050000)

·论著·

阿托伐他汀对哮喘大鼠气道炎症、重塑及血清学相关炎症指标的影响

潘文森1，肖冉冉1，关继涛2，李爱民3，杨红申1

(1.河北医科大学第二医院呼吸二科，河北 石家庄 050000;2.河北医科大学第二医院呼吸一科，河北 石家庄 050000;3.河北医科大学第二医院生殖医学科，河北 石家庄 050000)

目的探讨阿托伐他汀对卵清白蛋白致敏哮喘模型大鼠气道炎症和重塑的影响。方法清洁级健康SD雄性大鼠24只按随机数字表法分为对照组、哮喘组和阿托伐他汀组，每组8只。大鼠哮喘模型采用卵清白蛋白致敏和激发，0.9%氯化钠溶液进行致敏和激发的大鼠为对照组，阿托伐他汀组在致敏和激发前以阿托伐他汀灌胃。采用肺功能检测3组大鼠气道呼气阻力；ELISA法测定3组实验动物血清中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质金属蛋白酶9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)及其组织学抑制物1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)的水平，并计算MMP-9/TIMP-1比值。结果哮喘组和阿托伐他汀组气道阻力高于对照组，阿托伐他汀组气道阻力低于哮喘组(P<0.05)。病理检查显示哮喘组气道炎症明显，阿托伐他汀组与之相比炎症轻微。哮喘组和阿托伐他汀组TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平高于对照组,MMP-9/TIMP-1低于对照组,阿托伐他汀组TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平低于哮喘组(P<0.05)；阿托伐他汀组MMP-9/TIMP-1与哮喘组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论阿托伐他汀能够明显降低哮喘大鼠的气道基本阻力，减轻哮喘大鼠气道炎症。阿托伐他汀治疗能够降低血清中TGF-β1、VEGF、MMP-9及TIMP-1水平，或为其减轻炎症及气道重塑的机制。

哮喘；阿托伐他汀；大鼠

支气管哮喘的病生理学改变主要为慢性气道炎症，并伴随内膜、肌层增厚等气道重塑改变[1-2]。气道重塑与多种促纤维化细胞因子有关，其中转化生长因子β1(transforminggrowfactor-β1,TGF-β1)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)与之关系尤为密切[3-4]。基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)可分解胞外基质破坏气道壁基底膜，基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase-1,TIMP-1)是MMP-9的内源性抑制剂，在哮喘病两者之间的平衡被认为可能与气道重塑有关联[5]。另外一些研究证实，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorsγ,PPARγ)参与调控炎症相关细胞，应用PPARγ激动剂能够同时抑制气道炎症和气道重塑过程，他汀类药物能增加人外周血单核细胞上PPARγ的表达，或许是其影响哮喘发病的机制之一[6-8]。本研究以阿托伐他汀干预哮喘大鼠，通过观察大鼠血清中VEGF、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1的水平及MMP-9/TIMP-1比值变化，探讨阿托伐他汀在哮喘发病中的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物 采用购买的SD大鼠，雄性，24只，平均体质量200g。随机数字表法分为对照组、哮喘组和阿托伐他汀3组，每组8只。

1.1.2 实验试剂 应用VEGF、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1ELISA试剂盒(美国R&D公司)；鸡卵清白蛋白(美国Sigma公司)；阿托伐他汀(美国辉瑞)。

1.2 实验方法

1.2.1 致敏和激发 哮喘组：实验开始1d、7d， 腹腔注射含OVA100mg和氢氧化铝100mg的混悬液2mL和百日咳疫苗1mL。自15d开始，隔日1次，每次30min，雾化吸入OVA进行激发。激发4次后增加1次OVA浓度，激发浓度分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%，累计激发20次。阿托伐他汀组：实验流程同哮喘组，同时服用阿托伐他汀4mg·kg-1·d-1，至研究结束。对照组：试验流程同哮喘组，致敏、激发均选择生理盐水。

1.2.2 气道阻力测试 大鼠麻醉后(腹腔注射，戊巴比妥钠，100mg/kg)，气管切开并插管，接呼吸机机械通气，稳定后检测气道阻力。

1.2.3VEGF、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1的ELISA检测 处死动物，穿刺右心室采血，3 000r/min离心10min，留取血清。按试剂盒说明书，检测VEGF、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1水平。

1.2.4 制作病理标本 4%甲醛固定右肺上叶，酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡后冷却、石蜡包埋。切片机切片(厚约5μm)，干燥、二甲苯脱蜡，常规苏木精及伊红(HE)染色，观察组织病理变化。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计学软件分析数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组气道阻力比较 哮喘组和阿托伐他汀组气道阻力高于对照组，阿托伐他汀组气道阻力低于哮喘组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 病理学结果 对照组大鼠支气管、肺组织均呈正常表现，支气管管腔规则，黏膜上皮、肌层结构正常，肺组织结构规则无异常，所检组织均未见炎症改变；哮喘组大鼠可见支气管黏膜破坏，明显的炎症细胞浸润，可见基底膜增厚，平滑肌细胞增殖，杯状细胞表达增加，黏液分泌增加；阿托伐他汀组大鼠镜下可见黏膜破坏，炎症细胞浸润及杯状细胞表达增加，黏液分泌也有增加，但与较哮喘组相比明显减轻。见图1。

表1 3组气道阻力比较
Table1Comparisonofairwayresistanceamongthreegroups

组别 气道阻力对照组 1.093±0.212哮喘组 1.779±0.159*阿托伐他汀组1.454±0.111*#F 73.976P 0.000

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与哮喘组比较(q检验)

图1大鼠肺组织

A.对照组(HE ×100);B.对照组(HE ×200)；C. 哮喘组(HE ×100);D.哮喘组(HE ×200);E.阿托伐他汀组(HE ×100);F.阿托伐他汀组(HE ×200)

Figure1Thelungtissueofrats

2.3 3组血清TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比较 哮喘组和阿托伐他汀组TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平高于对照组,MMP-9/TIMP-1低于对照组,阿托伐他汀组TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平低于哮喘组,差异均有统计学意义(P<0.05)；阿托伐他汀组MMP-9/TIMP-1与哮喘组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别 TGF-β1(μg/L)VEGF(ng/L)MMP-9(μg/L)TIMP-1(μg/L)MMP-9/TIMP-1对照组 21.12±2.17129.53±8.8522.6±4.221.3±4.31.084±0.196哮喘组 60.69±7.27*196.54±13.58*60.8±6.2*73.3±5.5*0.829±0.057*阿托伐他汀组38.89±5.40*#159.78±14.17*#42.1±5.9*#45.6±4.4*#0.925±0.138*F 108.65458.32295.069239.4656.542P 0.0010.0010.0010.0010.193

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与哮喘组比较(q检验)

3 讨 论

支气管哮喘的基本发病机制和病理特征是气道炎症和气道重塑，急性发病或症状迁延不愈、控制不佳时气道管壁黏膜充血、水肿、增厚及分泌增加，随病程进展逐渐出现平滑肌增生、肥大和基底膜增厚、气道内径减小等不完全可逆性改变，这些病理特征是气道阻力大幅度增加，临床上出现咳嗽、喘息及呼吸困难等的主要原因[1-2]。以往研究显示，哮喘组大鼠气道内可见明显黏膜充血、水肿及破坏，炎症细胞浸润，杯状细胞增加，黏液分泌亢进，基底膜增厚，平滑肌细胞增殖，所见气道内腔缩窄甚至闭锁，呈现典型的哮喘病理改变，肺功能检查提示气道阻力较对照组显著增加[9]。进一步分析本研究中病理学和肺功能指标，可见阿托伐他汀组大鼠气道炎症改变较哮喘组显著改善，肺功能检测的气道阻力也显著降低，提示阿托伐他汀或许通过减轻炎症反应来改善气道阻力。

炎症是造成气道重塑的主要原因。TGF-β1在哮喘气道炎症和重塑的研究中尤为重要[3]。TGF-β1是体内重要的促纤维化细胞因子，可能通过多个环节与途径影响气道重塑。因此，结合以往研究可以推断TGF-β1过度表达或许与气道重塑有关。本研究哮喘组与对照组相比，血清中TGF-β1水平显著升高，病理学可见气道炎症、重塑指标显著加重，进一步验证了TGF-β1的重要作用[9]。

血管生成是哮喘发病机制中气道炎症和组织重塑发生发展的重要阶段，VEGF是血管生成重要病理生理基础[10]。VEGF与哮喘气道重塑的发生存在密切的关系，其可能的机制是通过影响气道血管生成和平滑肌增生肥大而发生[4]。气道平滑肌细胞可以分泌VEGF，同时平滑肌细胞有VEGF受体表达，VEGF调节平滑肌细胞功能，影响气道平滑肌细胞基质的合成，增加内皮和血管平滑肌细胞的迁移。近期研究表明，升高的VEGF与哮喘患者症状控制不佳密切相关[11]。国内学者针对VEGF基因多态性的研究发现，VEGF单核苷酸序列中rs3025020和rs3025039多态性或许与哮喘发病有关[12]。针对过敏性鼻炎的研究也发现，循环中VEGF及其可溶性受体也与发病机制相关[13]。

MMP-9可分解胞外基质破坏气道壁基底膜，TIMP-1是MMP-9的内源性抑制剂，两者之间的平衡直接影响哮喘患者的气道重塑[5]。以往的研究中，主要针对糖皮质激素对于MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比例的影响，针对他汀类药物研究较少。本研究结果显示，阿托伐他汀组MMP-9、TIMP-1显著低于哮喘组(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1与哮喘组差异无统计学意义(P>0.05)。提示阿托伐他汀改善气道炎症及重塑或与抑制MMP-9过度分泌有关，MMP-9分泌下调后，内源性TIMP-1相应下调，MMP-9/TIMP-1比例轻度升高。除了大量的动物实验外，Chaudhuri等[14]的临床研究发现，吸烟的哮喘患者痰液中MMP-9/TIMP-1下降与气道缩窄有关。本研究结果与其趋势相一致。但本研究中阿托伐他汀组与哮喘组MMP-9/TIMP-1差异无统计学意义，或与检测时机有关，TIMP-1的变化较MMP-9有约2周的延迟，这需要进一步的研究来证实。

PPARs(尤其是PPARγ)与哮喘气道炎症和重塑相关，诸多研究显示PPARγ激动剂能明显抑制哮喘炎症细胞的活化以及细胞因子的释放[6]。PPARγ激动剂环格列酮能降低哮喘小鼠BALF中嗜酸粒细胞和淋巴细胞数量以及肿瘤坏死因子2α等细胞因子的水平。另一种PPARγ激动剂罗格列酮能抑制纵隔淋巴结内T 细胞的增殖和活化，并能影响淋巴结内细胞因子如白细胞介素和干扰素γ的水平，能抑制OVA 诱导的气道内嗜酸粒细胞聚集。因此，推断PPARγ激动剂或可作为哮喘治疗的新靶点[7-9]。但是，这一推论在临床实践中并未得到确切证实[15]。已证实他汀类药物可以改善气道重塑[16-17]。他汀类药物还可以增强糖皮质激素对于CD4+淋巴细胞Th17/调节性T细胞的平衡作用[18]。虽然机制尚未完全明了，Huang等[19]研究发现他汀类药物可以有效减少哮喘患者急性发作引起的住院需求。

本研究结果显示阿托伐他汀干预改善了大鼠的气道炎症及重塑过程，大鼠血清TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1水平低于模型组。推测阿托伐他汀或许通过上调PPARγ的表达，进而影响TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1，并最终改善了气道炎症和重塑。

总之，阿托伐他汀可能通过影响TGF-β1、VEGF、MMP-9、TIMP-1代谢，调节气道炎症和重塑，其机制有待更深入的研究揭示。

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(本文编辑：赵丽洁)

Effect of atorvastatin on airway inflammation, remodeling and serology related inflammatory indexes in asthmatic rats

PAN Wen-sen1， XIAO Ran-ran1， GUAN Ji-tao2， LI Ai-min3， YANG Hong-shen1

(1.TheSecondDepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhang050000，China; 2.TheFirstDepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhang050000，China; 3.DepartmentofReproductiveMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhang050000，China)

ObjectiveToexploretheeffectsofatorvastatinonairwayinflammationandremodelinginratswithasthma.MethodsSDmaleratswereusedasexperimentalanimals.Twenty-fourratsweredividedintothreegroupsrandomly.Theasthmagroupandatorvastatingroupweresensitizedandchallengedbyovalbumin.Salinewereusedtobethesensitizedandchallengeddruginthecontrolgroup.Airwayresistanceoftheanimalswasmeasuredbyanimallungfunctionmeter.Theairwayinflammationwasobservedbypathologicalmethod.Thelevelsofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF),transforminggrowthfactor-β1(TGF-β1),matrixmetalloproteinase-9(MMP-9)andtissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase-1(TIMP-1)inserumweremeasuredbyELISA.AndtheMMP-9/TIMP-1ratiowasalsobeencalculated.ResultsTheairwayresistancewashigherinasthmagroupandatorvastatingroupthanthatinnormalcontrolgroup.Andtheairwayresistancewaslowerinatorvastatingroupthanthatinasthmagroup(P<0.05).Theinflammationobservedbypathologicalmethodwasobviousinasthmamodelgroup,andthatwereslighterinatorvastatingroupswhencomparedwithasthmamodelgroup.ThelevelsofTGF-β1,VEGF,MMP-9andTIMP-1werehigherinasthmamodelgroupandatorvastatingroupthannormalcontrolgroup,andtheMMP-9/TIMP-1ratioinnormalcontrolgroupwerelowerthanasthmagroupandatorvastatingroup.ThelevelsofTGF-β1,VEGF,MMP-9andTIMP-1werelowerinatorvastatingroupcomparedwithasthmamodelgroup(P<0.05),buttherewasnoobviousdifferenceintheMMP-9/TIMP-1ratiobetweenasthmamodelgroupandatorvastatingroup(P>0.05).ConclusionAtorvastatinimproveairwayresistance,inflammationandremodelinginratswithasthma.AtorvastatincoulddecreasetheserumlevelsofVEGF,TGF-β1,MMP-9andTIMP-1,whichmayplayimportantrolesinpreventionofinflammationandremodeling.

asthma;atorvastation;rats

2017-06-14；

2017-07-12

河北省医学科学研究重点课题(20100068)

潘文森(1974 -)，男，河北景县人，河北医科大学第

R562.25

A

1007-3205(2017)09-1007-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.004

二医院主任医师，医学博士，从事呼吸系统疾病诊治研究。