右美托咪定对脑缺血缺氧新生大鼠神经功能的影响

薄立军，于沛霞，黄立宁，薛 辉，康荣田*

(1.河北医科大学第二医院麻醉科，河北 石家庄 050000；2. 河北医科大学第三医院麻醉科，河北 石家庄 050051； 3.河北省邯郸市第四医院麻醉科，河北 邯郸 056200)

·论著·

右美托咪定对脑缺血缺氧新生大鼠神经功能的影响

薄立军1，于沛霞2，黄立宁1，薛 辉3，康荣田1*

(1.河北医科大学第二医院麻醉科，河北 石家庄 050000；2. 河北医科大学第三医院麻醉科，河北 石家庄 050051； 3.河北省邯郸市第四医院麻醉科，河北 邯郸 056200)

目的观察右美托咪定对脑缺血缺氧新生大鼠神经凋亡以及对神经功能和长期学习记忆能力的影响。方法7天龄SD大鼠90只。建立大鼠(7 d)脑缺血缺氧损伤(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)模型。假手术组(S)仅进行手术而不造成缺氧状态；HIE模型组(R)持续缺氧2 h；右美托咪定25 μg /kg组(D1)、右美托咪定50 μg/kg组(D2)，于HIE 2 h后，即刻分别静脉注射右美托咪定25 μg/kg 、50 μg/kg；育亨宾组(Y)，于HIE 2 h后，即刻静脉注射给予右美托咪定50 μg/kg和育亨宾5 μg。Western blot法检测各组干预后24 h，caspase-3表达和新生大鼠神经功能评分；干预后4周后，Morris水迷宫检测学习记忆能力的变化。结果干预后24 h，R组caspase-3表达和神经功能评分明显高于S组，D1组、D2 组和Y组低于R组，Y组高于D1组和D2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。干预后4周后，Morris水迷宫逃避潜伏期第1～5天逐渐缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)。第1天各组逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)；第2、3、4、5天，R组逃避潜伏期较S组延长，D1组、D2组、Y组较R组缩短，Y组长于D1组、D2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。R组目标像限停留时间明显少于S组，D1组、D2组、Y组明显多于R组，Y组少于D1和D2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。D1与D2组神经功能评分、caspase-3表达、水迷宫检测差异均无统计学意义。结论脑缺血缺氧导致新生大鼠脑海马组织神经元凋亡增多，远期新生大鼠学习记忆能力降低；右美托咪定25 μg/kg、50 μg/kg均抑制caspase-3表达，减少神经元的凋亡，并改善新生大鼠远期学习记忆能力。

缺氧缺血，脑；模型，动物；右美托咪定

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemicencephalopatly,HIE)是由围产期窒息导致的脑缺氧缺血性损害,临床以意识障碍、肌张力及原始反射改变、惊厥、脑水肿、颅内高压为主的神经系统表现,是新生儿死亡及影响神经预后的严重疾病[1-2]。右美托咪定是α2受体兴奋剂，已广泛应用于临床麻醉和重症监护室。研究表明，右美托咪定对HIE有神经保护作用[3-5]。右美托咪定的神经保护作用与其药物机制和α2受体相关，它能够减少capase-3、bcl-2等的表达和神经元的凋亡[6]，但目前还没有其对HIE长期影响的研究。本研究通过动物实验建立新生大鼠HIE模型，探讨右美托咪定对新生大鼠HIE的影响，尤其是对长期神经功能、学习能力的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康7天龄SD大鼠90只，体质量11～16g(河北省实验动物中心提供)。采用随机数字表法分成5组，每组18只: 假手术组(S组)、HIE模型组(R组)、右美托咪定25μg/kg(D1组)、50μg/kg组(D2组)、育亨宾5μg组(Y组)。

1.2 模型制备Rice方法[7]建立大鼠HIE模型。SD大鼠于术前禁食6h，自由饮水，环境温度19～22 ℃。假手术组：仅进行手术而不造成缺血缺氧。HIE模型组：行HIE模型手术。新生大鼠行左侧颈总动脉永久性结扎,2h后置于玻璃缺氧箱中，37℃恒温,输入氧浓度为(8±0.1)%的氮氧混合气体持续缺氧2h，右美托咪定25μg/kg、50μg/kg组于持续缺氧2h后即刻分别尾静脉一次性注射给予右美托咪定(批号：13112332，江苏恒瑞医药有限公司)25μg/kg、50μg/kg。假手术组和HIE模型组，给予同量的生理盐水。育亨宾组给予右美托咪定50μg/kg和育亨宾5μg(批号：552206，J&KScientificLtd)。每组均母鼠喂养24h。

1.3 神经功能缺损评分 各组大鼠干预24h后，采用五点量表法评估神经行为，由不知道动物分组的研究者操作。每组随机选取6只。正常(无神经功能缺损)0分：大鼠表现正常，完全可以伸开前肢和抬起尾巴；神经功能缺损1分：大鼠不能完全伸展其左前肢，抬起尾巴困难；神经功能缺损2分：大鼠已经减少抗侧推，并有轻度神经行为；神经功能缺损3分：转身成一个圆圈，并有轻度和中度神经行为；神经功能缺损4分：走路不协调，并有轻度意识障碍。

1.4Westernblot法检测caspase-3表达 新生大鼠于干预24h后，每组随机选取6只，在冰板上立即处死大鼠，取海马，储存-80 ℃冰箱备用。Westernbolt按文献描述方法进行[8]。样品的蛋白质浓度采用BCA法测定。采用抗裂解的caspase-3(1∶1 000 ，Affinity公司)一抗和二抗，抗β-actin(1∶500，Affinity公司)，用凝胶电泳成像分析系统扫描PVDF膜，用ChemiScopeCapture软件曝光并捕捉图像，利用GelImageAnalysisV2.02软件分析各条带的灰度值。

1.5Morris水迷宫实验 每组剩余新生大鼠6只，继续喂养4周，行Morris水迷宫检测。水迷宫直径150cm，深度50cm， 水深40cm，水温22°C。分别行定位导航和空间探索实验。预先设定4个象限，进行5d的学习和记忆，每天4次，将以12cm圆形平台置于一定位置并淹没1cm。如果动物60s未找到平台，潜伏期为60s。撤出平台，将大鼠随机置入水中，采用摄像机记录其活动，记录其60s探索轨迹和不同象限停留时间。

1.6 统计学方法 应用SPSS23.0统计软件处理数据，计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组caspase-3表达、神经功能评分比较 干预后24h,R组caspase-3表达和神经功能评分明显高于S组，D1组、D2 组和Y组低于R组，Y组高于D1组和D2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表 1，图1。

组别caspase-3神经功能评分(分)S组 0.078±0.012 0.000±0.000 R组 0.468±0.031*3.501±0.551*D1组0.221±0.024*#1.502±0.541*#D2组0.200±0.021*#1.333±0.510*#Y组 0.305±0.211*#△☆2.667±0.521*#△☆F236.81247.574P0.0000.000

*P<0.05与S组比较 #P<0.05与R组比较 △P<0.05与D1组比较 ☆P<0.05与D2组比较

图1各组Western blot检测结果

Figure1TheresultofWesternblot

2.2 Morris水迷宫实验 干预后4周后，各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期从第1～5天逐渐缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)。第1天各组逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)；第2、3、4、5天，R组逃避潜伏期较S组延长，D1组、D2组、Y组较R组缩短，Y组长于D1组、D2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。R组目标象限停留时间明显少于S组，D1组、D2组、Y组明显多于R组，Y组少于D1和D2组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别逃避潜伏期第1天第2天第3天第4天第5天目标象限停留时间S组 57.67±0.8247.50±1.05a34.50±2.07ab25.83±0.75abc20.67±1.03abcd30.000±1.788R组 59.00±1.2649.50±1.05*a47.17±1.47*ab42.00±1.41*abc39.01±0.89*abcd12.001±1.414*D1组58.17±0.7548.00±0.63#a39.83±1.47*#ab32.50±1.38*#abc27.10±0.99*#abcd22.833±1.472*#D2组57.83±1.1748.02±0.65#a39.17±1.32*#ab32.00±1.41*#abc26.01±0.94*#abcd23.500±1.870*#Y组 58.16±1.1748.33±1.03#a43.00±1.03*#△☆ab37.01±1.32*#△☆abc31.11±0.88*#△☆abcd17.167±1.722*#△☆F1.4224.16044.921129.203327.109100.982P0.2560.0110.0000.0000.0000.000

*P<0.05与S组比较 #P<0.05与R组比较 △P<0.05与D1组比较 ☆P<0.05与D2组比较 aP<0.05与第1天比较 bP<0.05与第2天比较 cP<0.05与第3天比较 dP<0.05与第4天比较(SNK-q检验)

3 讨 论

临床统计结果表明新生儿HIE的发病率约为足月婴儿的2/1 000，早产儿6/1 000[9]。HIE给新生儿带来严重的损害甚至危及生命，主要临床表现包括肢体麻痹、癫痫、行为异常和神经发育缺陷等。HIE是由于脑组织氧供氧耗严重失衡，导致神经细胞死亡和炎性细胞因子释放导致级联反应，进一步促进神经细胞凋亡，影响神经功能。目前临床多采用低温和支持疗法，但其效果十分有限，迫切需要探索有效的神经保护措施和治疗药物，以进一步减少HIE引起的新生儿死亡和严重的长期损害[10]。研究表明右美托咪定能够减轻HIE造成的神经功能损伤，故本研究采用新生大鼠HIE模型缺血缺氧2 h后即刻尾静脉注射右美托咪定的治疗方案，观察其能否减轻HIE导致的新生大鼠脑损伤以及对长期神经功能的影响。

到目前为止，新生鼠是最常见的围产期HIE损伤动物模型，其主要优势是能够更好地观察HIE的长期影响。因此，本研究采用新生大鼠HIE模型。本研究中HIE模型组新生大鼠caspase-3表达和神经行为评分明显高于假手术组，证明本研究HIE模型成功可行。凋亡主要的发生途径：依赖caspase-3和非依赖caspase-3途径[11]。有学者研究表明右美托咪定在脑缺血期间和之前应用，具有一定的神经保护作用[12]。同时右美托咪定可以通过血脑屏障激活α2受体，更容易减轻脑损伤，起到神经保护作用。在异氟醚诱导的神经毒性作用的研究中，有学者应用25 μg、50 μg、75 μg右美托咪定，发现右美托咪定能够改善异氟醚诱导的神经损伤，同时发现3种剂量没有明显不同[8]。因此，本研究采用25 μg、50 μg 2种剂量右美托咪定单次给药，观察其对HIE模型缺氧2 h后脑神经功能的影响，结果显示HIE模型缺氧2 h即刻caspase-3和神经功能缺损评分明显升高，给予25 μg、50 μg右美托咪定均能够减少caspase-3活化，改善干预后24 h新生大鼠的神经功能，且2种剂量右美托咪定(25 μg 、50 μg)减少caspase-3活化的程度差异无统计学意义。表明应用25 μg、50 μg右美托咪定，能够改善HIE模型诱导的神经损伤，同时发现2种剂量没有明显不同。

本研究发现同时应用育亨宾5 μg和右美托咪定50 μg， caspase-3活化量较单纯应用右美托咪定50 μg明显增加；应用育亨宾5 μg和右美托咪定50 μg干预后24 h，神经功能改善明显好于HIE模型组，而明显差于右美托咪定组。育亨宾作为α2受体特异性的阻断剂，能够阻断右美托咪定的α2受体激动作用。本研究结果显示育亨宾组仍然存在改善神经功能的作用。因此，进一步证明了右美托咪定在新生大鼠HIE模型中发挥的神经保护作用与α2受体有关，但还存在其他作用机制。这与Xiong等[13]的研究相一致。本研究应用Morris水迷宫分别对干预后4周的大鼠进行定位导航和空间探索实验，进一步分析干预对长期神经行为学和学习记忆的影响，结果显示各组在训练的第1～5天逃避潜伏期逐渐缩短，第1天各组逃避潜伏期无明显差异，第2、3、4、5天，右美托咪定25 μg、50 μg组明显短于HIE模型组和育亨宾组，而长于假手术组，育亨宾组明显短于HIE模型组；HIE模型组目标象限停留时间明显短于右美托咪定25 μg和50 μg组、育亨宾组、假手术组，右美托咪定25 μg、50 μg组停留时间少于假手术组而多于育亨宾组。表明新生大鼠HIE模型导致大鼠4周的行为和学习记忆能力降低，右美托咪定能够改善HIE长期的神经损伤的影响，改善新生大鼠HIE后的神经功能。本研究的不足之处为仅观察了右美托咪定2个剂量，应用更多不同剂量观察右美托咪定的作用有待进一步探讨。

总之，右美托咪定25 μg、50 μg能够减轻新生大鼠HIE的神经凋亡，改善新生大鼠短期、长期的神经功能和学习记忆能力。右美托咪定的神经保护作用与α2受体有关，但还存在其他作用机制。

[1] Liu L,Oza S,Hogan D,et al. Global,regional,and national causes of child mortality in 2000-13,with projections to inform post-2015 priorities:an updated systematic analysis[J]. Lancet,2015,385(9966):430-440.

[2] Shankaran S,Laptook AR,McDonald SA,et al. Acute Perinatal Sentinel Events,Neonatal Brain Injury Pattern,and Outcome of Infants Undergoing a Trial of Hypothermia for Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy[J]. J Pediatr,2017,180:275-278.

[3] Ezzati M,Broad K,Kawano G,et al. Pharmacokinetics of dexmedetomidine combined with therapeutic hypothermia in a piglet asphyxia model[J]. Acta Anaesthesiol Scand,2014,58(6):733-742.

[4] Alam A,Suen KC,Hana Z,et al. Neuroprotection and neurotoxicity in the developing brain:an update on the effects of dexmedetomidine and xenon[J]. Neurotoxicol Teratol,2017，60：102-116.

[5] Ren X,Ma H,Zuo Z. Dexmedetomidine postconditioning reduces brain injury after Brain hypoxia-ischemia in neonatal rats[J]. J Neuroimmune Pharmacol,2016,11(2):238-247.

[6] Wei Y,Hu J,Liang Y,et al. Dexmedetomidine pretreatment attenuates propofol-induced neurotoxicity in neuronal cultures from the rat hippocampus[J]. Mol Med Rep,2016,14(4):3413-3420.

[7] 王琍琍,王杨,宣桂华,等.新生大鼠脑缺氧缺血损伤模型的建立[J].安徽医科大学学报,2004,39(4):259-261.

[8] Li Y,Zeng M,Chen W,et al. Dexmedetomidine reduces isoflurane-induced neuroapoptosis partly by preserving PI3K/Akt pathway in the hippocampus of neonatal rats[J]. PLoS One,2014,9(4):e93639.

[9] Laptook AR. Birth asphyxia and hypoxic-ischemic brain injury in the preterm infant[J]. Clin Perinatol,2016,43(3):529-545.

[10] Ranchhod SM,Gunn KC,Fowke TM,et al. Potential neuroprotective strategies for perinatal infection and inflammation[J]. Int J Dev Neurosci,2015,45:44-54.

[11] Suh H,Choi KW,Lee J,et al. Effects of a novel carbocyclic analog of pyrrolo[2,3-d] pyrimidine nucleoside on pleiotropic induction of cell death in prostate cancer cells with different androgen responsiveness[J]. Bioorg Med Chem Lett,2016,26(4):1130-1135.

[12] Zhu YM,Wang CC,Chen L,et al. Both PI3K/Akt and ERK1/2 pathways participate in the protection by dexmedetomidine against transient focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Brain Res,2013,1494:1-8.

[13] Xiong B,Shi QQ,Miao CH. Dexmedetomidine renders a brain protection on hippocampal formation through inhibition of nNOS-NO signalling in endotoxin-induced shock rats[J]. Brain injury,2014,28(7):1003-1008.

(本文编辑：许卓文)

Effects of dexmedetomidine on neurological function in neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy

BO Li-jun1， YU Pei-xia2, HUANG Li-ning1， Xue Hui3， Kang Rong-Tian1*

(1.DepartmentofAnesthesiology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050051，China；2.DepartmentofAnesthesiology，theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China; 3.DepartmentofAnesthesiology,theForthHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056200，China)

ObjectiveToobservetheeffectofdexmedetomidineonneuronalapoptosisinneonatalratswithcerebralischemiaandhypoxia,andtoexploretheeffectofdexmedemidineonneurologicalfunctionandlong-termlearningandmemoryability.MethodsHypoxic-ischemicencephalopathy(HIE)wasbuiltforthemodelofcerebralischemiaandhypoxia.Ninetyseven-day-old(P7)Sprague-Dawleyratswererandomizedintofivegroups:shamoperationgroup(S),theHIEgroup(R),thedexmedetomidine(25μg/kg)group(D1),thedexmedetomidine(50μg/kg)group(D2),theyohimbinegroup(5μg)(Y).P7ratswereoperatedwithouthypoxiainSgroup,andcontinuedhypoxiafor2hinRgroup.AfterHIE2h,P7ratswerepretreatedwithdifferentconcentrationsofdexmedetomidine(25μg/kg,)inD1group,andpretreatedwithdexmedetomidine(50μg/kg)inD2groupandyohimbine(5μg)inYgroup.After24h,theexpressionofcaspase-3wasdetected.Neurologicaldeficitscoreswereusedtoevaluateneurologicalfunction.For4weeksaftertheintervention,Morriswatermazetestwasusedtoevaluatethechangesinlearningandmemoryability.ResultsHIEinRgroupinducedtheup-regulationofcaspase-3andneurologicaldeficitscores,comparedwithSgroup(P<0.05).Dexmedetomidine(25μg/kg, 50μg/kg)andyohimbinepretreatmentmarkedlydown-regulatedtheexpressionofcaspase-3andneurologicaldeficitscores,comparedwithRgroup(P<0.05).TheescapelatencyofRgroupwasincreasedcomparedwithSgroup,andreducedwithD1,D2,Ygroupat2th,3th,4thand5thdayaftertraining(P<0.05).TheescapelatencyofbothD1andD2groupwerereducedat2th,3th,4thand5thday,andincreasedtimeoftargetquadrantcomparedwithRgroup,andreducedcomparedwithSgroup(P<0.05).Neurologicaldeficitscoresandtheexpressionofcaspase-3weresignificantlyreducedinYgroupcomparedwithD1andD2group(P<0.05).TherewerenotsignificantdifferencesbetweenD1andD2groupinneurologicaldeficitscores,theexpressionofcaspase-3andMorriswatermazetest.ConclusionHIEcausesneuronalapoptosisinthehippocampusofneonatalrats,anddecreasetheabilityoflearningangmemoryinlong-termneonatalrats.Theexpressionofcaspase-3wasinhibitedbydexmedetomidinepretreatment(25μg/kg, 50μg/kg),whichreducedtheapoptosisofneurons.DexmedetomidinetreatmentforneonatalratsduringHIEcouldimprovethelong-termlearningandmemoryabilityofneonatalrats.

hypoxic-ischemic,brain;modes,animal;dexmedetomidine

2017-06-14；

2017-08-18

河北省医学科学研究重点课题(20150222)

薄立军(1979-)，男，河北唐山人，河北医科大学第二医院主治医师，医学硕士，从事临床麻醉学研究。

*通讯作者。E-mail:535498241@qq.com

R735.7

A

1007-3205(2017)09-1068-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.018