黑枸杞水提物对中波紫外线辐射后人角质形成细胞增殖与凋亡及凋亡相关蛋白表达水平的影响研究

加杨娥，任立汆，燕华玲

·论著·

黑枸杞水提物对中波紫外线辐射后人角质形成细胞增殖与凋亡及凋亡相关蛋白表达水平的影响研究

加杨娥，任立汆，燕华玲*

目的研究黑枸杞水提物对中波紫外线(UVB)辐射后人角质形成(HaCaT)细胞增殖与凋亡及凋亡相关蛋白〔P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、P53、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)〕表达水平的影响，以期探讨黑枸杞水提物减轻UVB损伤HaCaT细胞的作用机制。方法2015年3月—2016年1月，提取黑枸杞水提物，体外培养HaCaT细胞，取对数生长期的HaCaT细胞，采用随机数字表法分为对照组(无辐射)、UVB组(30 mJ/cm2UVB辐射40 min)、黑枸杞水提物组(30 mJ/cm2UVB辐射40 min+黑枸杞水提物2 mg/ml)。采用MTS法检测各组细胞增殖活力，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，Western blotting法检测各组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平。结果UVB组细胞增殖活力小于对照组(P<0.05)；黑枸杞水提物组细胞增殖活力小于对照组，大于UVB组(P<0.05)。UVB组细胞凋亡率大于对照组(P<0.05)；黑枸杞水提物组细胞凋亡率大于对照组，小于UVB组(P<0.05)。UVB组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平高于对照组，Bcl-2表达水平低于对照组(P<0.05)；黑枸杞水提物组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平低于UVB组，Bcl-2表达水平高于UVB组(P<0.05)。结论黑枸杞水提物可促进UVB辐射后HaCaT细胞的增殖，同时阻止其凋亡，其机制可能为黑枸杞水提物能够下调P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平及上调Bcl-2表达水平，进而减轻HaCaT 细胞的辐射损伤。

枸杞△；紫外线；细胞增殖；细胞凋亡；P38丝裂原活化蛋白激酶；肿瘤抑制蛋白质p53；半胱氨酸蛋白酶类；B细胞淋巴瘤因子2

加杨娥，任立汆，燕华玲.黑枸杞水提物对中波紫外线辐射后人角质形成细胞增殖与凋亡及凋亡相关蛋白表达水平的影响研究[J].中国全科医学，2017，20(27)：3400-3404.[www.chinagp.net]

JIA Y E,REN L C,YAN H L.Effects of black wolfberry water extracts on proliferation and apoptosis and apoptosis-related-protein expression level of HaCaT cells after UVB radiation[J].Chinese General Practice，2017，20(27)：3400-3404.

黑枸杞为茄科，枸杞属，是近年来新发掘的多年生耐盐、抗旱野生植物，主要分布于青海、新疆、宁夏等地。《维吾尔药志》记载，黑枸杞可用于治疗尿道结石、牙龈出血等[1]。《晶珠本草》记载，黑枸杞用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等且药效显著，民间用于滋补强壮、降血压[2]。现代医学研究证明，黑枸杞含有多种有效成分，包括原花青素、多糖、酚酸、黄酮、氨基酸及K、Na、Fe、Ca、Mg等无机元素成分，具有降血压、降血脂、保护心血管、防治癌症、提高免疫力、抗氧化、抗衰老、缓解眼睛疲劳等多种功能，是一种安全无毒的“药食两用”的资源[2]。已有研究证实，中波紫外线(UVB)可诱导人角质形成(HaCaT)细胞凋亡，黑枸杞水提物能够减轻UVB辐射后HaCaT细胞的氧化损伤[3]，但关于其对P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、P53、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)相关蛋白表达水平的影响尚未见报道。因此本研究通过观察黑枸杞水提物对UVB辐射后HaCaT细胞增殖与凋亡及P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平的影响，探讨其减轻UVB辐射损伤的机制，以期为黑枸杞水提物减轻UVB损伤提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 黑枸杞干果购自青海德令哈市壹叶香茶行；HaCaT细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司；DMEM培养基和10%胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；金属硫蛋白混合体(MTS)购自Promega公司；RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所；十二烷基硫酸钠-聚丙基酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒购自Biosharp公司；一抗(抗P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2、β-actin抗体)购自Abcam公司；二抗(山羊抗兔抗体)购自Proteintech公司；发光液购自Thermo Fisher Scientific公司；BCA试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；Bio-Rad酶标仪(X-Mark型)购自Bio-Rad公司。

1.2 黑枸杞水提物的提取 准确称取黑枸杞干果100 g，加入蒸馏水500 ml，煮沸2 h，每15 min搅拌1次，过滤，滤渣中加入同样的蒸馏水继续煮沸，重复3次，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥获得黑枸杞水提物粉末。以含10% FBS的DMEM培养基为溶剂，配制成2 mg/ml的黑枸杞水提物溶液，用0.22 μm孔径的过滤器过滤，现配现用。

1.3 HaCaT细胞的培养 向装有HaCaT细胞的培养瓶中加入含有10% FBS和1%双抗(链霉素和青霉素)的DMEM培养基，置于37 ℃ 5% CO2的饱和湿度条件下培养。当细胞达80%～90%融合时，按1∶3比例传代，取处于对数生长期的3～5代HaCaT细胞用于实验。

1.4 实验分组 2015年3月—2016年1月，取对数生长期的HaCaT细胞，采用随机数字表法分为对照组、UVB组、黑枸杞水提物组，置于培养箱用胰酶消化3 min，当细胞变圆、间隙变大时，加入4～5倍含10% FBS的DMEM培养基终止消化，吹打为细胞悬液，调整细胞浓度为105个/ml和4×105个/ml，分别接种于96孔板和6孔板中(前者用于检测细胞增殖活力，后者用于检测细胞凋亡率和P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平)。黑枸杞水提物组于UVB辐射前12 h加入黑枸杞水提物2 mg/ml，对照组和UVB组只加入相同量的培养基。各组于UVB辐射前弃去培养基，加入少量的磷酸盐缓冲液(PBS)，防止细胞干燥。将96孔板或6孔板置于15 W UVB灯管的正下方，距离20 cm，辐射时间为40 min，强度30 mJ/cm2，其中对照组用锡箔纸遮蔽。辐射结束后，弃去PBS，加入新的培养基继续培养20 h。

1.5 实验方法

1.5.1 MTS法检测细胞增殖活力 采用MTS法检测各组细胞增殖活力。各组每孔中加入20 μl MTS，置于培养箱中孵育3 h，采用Bio-Rad酶标仪测定各孔在490 nm处的吸光度，即细胞增殖活力。实验独立重复4次。

1.5.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 弃去各组原培养基，用预冷的PBS冲洗3遍，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞，收集并用1×膜联蛋白缓冲液稀释成106个细胞/ml，取100 μl细胞悬液，加入5 μl Annexin V和5 μl PI工作液，室温避光孵育15 min后加入400 μl 1×膜联蛋白缓冲液，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验独立重复3次。

1.5.3 Western blotting法检测P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平 收集各组细胞，采用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白并采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书配制12%的胶，上样，SDS-PAGE、转膜、封闭后，经一抗(抗P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2、β-actin抗体)、二抗(山羊抗兔抗体)孵育后加入发光液，暗室曝光，采用Quantity One分析各组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平。实验独立重复3次。

2 结果

2.1 细胞增殖活力比较 3组细胞增殖活力比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中UVB组细胞增殖活力小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黑枸杞水提物组细胞增殖活力小于对照组，大于UVB组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 细胞凋亡率比较 3组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中UVB组细胞凋亡率大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黑枸杞水提物组细胞凋亡率大于对照组，小于UVB组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图1)。

2.3P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平比较 3组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中UVB组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平高于对照组，Bcl-2表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；黑枸杞水提物组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平低于UVB组，Bcl-2表达水平高于UVB组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3、图2)。

表1 各组细胞增殖活力比较±s，n=4)

注：UVB=中波紫外线；与对照组比较，aP<0.05；与UVB组比较，bP<0.05

表2 各组细胞凋亡率比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与UVB组比较，bP<0.05

表3 各组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平比较

注：P38MAPK=P38丝裂原活化蛋白激酶，caspase-8=半胱氨酸蛋白酶-8，caspase-3=半胱氨酸蛋白酶-3，Bcl-2=B细胞淋巴瘤因子2；与对照组比较，aP<0.05；与UVB组比较，bP<0.05

注：A为对照组，B为中波紫外线(UVB)组，C为黑枸杞水提物组

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡率

Figure1 Cell apoptosis detected by flow cytometry

注：UVB=中波紫外线，P38MAPK=P38丝裂原活化蛋白激酶，caspase-8=半胱氨酸蛋白酶-8，caspase-3=半胱氨酸蛋白酶-3，Bcl-2=B细胞淋巴瘤因子2

图2 Western blotting法检测P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表达水平的SDS-PAGE图

Figure2 SDS-PAGE of Western blotting for detecting expression level of P38MAPK,P53,caspase-8,caspase-3,and Bcl-2

3 讨论

人体的衰老与紫外线有着直接的关系，长期紫外线辐射会引起皮肤形态学、组织学和生理学改变，其中对人体造成损害的主要是UVB，且UVB辐射具有遗传毒性，而HaCaT细胞是紫外线作用的主要靶细胞[4]。黑枸杞活性成分(多糖、花色苷、原花青素、酚酸和黄酮)具有较强的抗氧化、抗衰老活性，被原卫生部列为“药食两用”品种，长期服用可增强人体抵抗力[2]。目前对黑枸杞水提物的研究较少，但对枸杞多糖及花青素的研究较多。本研究以30 mJ/cm2的UVB辐射HaCaT细胞，建立UVB损伤细胞模型，结果显示，UVB组细胞增殖活力小于对照组，细胞凋亡率大于对照组，提示UVB辐射可诱导HaCaT细胞凋亡。黑枸杞水提物组细胞增殖活力小于对照组，大于UVB组；黑枸杞水提物组细胞凋亡率大于对照组，小于UVB组，与既往研究结果一致[5]；提示黑枸杞水提物可促进UVB辐射后HaCaT细胞的增殖，同时阻止UVB辐射后HaCaT细胞的凋亡，但不能完全抑制UVB的损伤。

既往研究证明，UVB辐射可增加细胞内游离Ca2+，激活P38、P53的表达，特异性降低Bcl-2表达水平，引起caspase蛋白酶解级联反应，导致细胞凋亡[6]。P53的活化受P38的调控，活化的caspase-8在胞质中裂解Bcl-2家族成员Bid，诱导线粒体释放细胞色素C[7]进而激活caspase-3，形成凋亡小体[8]，诱导细胞凋亡[9-12]。caspase-3被认为是细胞凋亡的标志酶[13]。Bcl-2可通过抑制自由基的产生、细胞内Ca2+超载、线粒体膜的通透性[14]，阻止细胞色素C的释放及caspase激活等机制发挥抑制细胞凋亡的作用。但目前尚未见黑枸杞水提物能否通过降低P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平，升高Bcl-2表达水平来减轻UVB辐射后HaCaT细胞凋亡的相关报道。因此，本课题组通过观察凋亡相关蛋白(P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2)表达水平，来探讨黑枸杞水提物能否通过降低P38MAPK通路凋亡因子的表达水平来减轻UVB辐射后HaCaT细胞的凋亡。

本研究结果显示，UVB组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平高于对照组，Bcl-2表达水平低于对照组，提示UVB辐射可能通过增加凋亡相关蛋白P38MAPK、P53、caspase-3、caspase-8表达水平和降低Bcl-2表达水平来诱导HaCaT细胞凋亡。黑枸杞水提物组P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平低于UVB组，Bcl-2表达水平高于UVB组，提示黑枸杞水提物可能通过下调P38MAPK、P53、caspase-8表达水平及上调Bcl-2表达水平，进而降低caspase-3表达水平从而减轻UVB辐射后HaCaT 细胞的凋亡。

本研究仅限于细胞水平的体外实验，并未行动物实验、体内实验，且黑枸杞水提物是否能通过其他凋亡途径来减轻UVB对HaCaT细胞造成的凋亡现象尚有待进一步研究。

综上所述，黑枸杞水提物可促进UVB辐射后HaCaT细胞的增殖，同时阻止其凋亡，其机制可能为黑枸杞水提物能够下调P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表达水平及上调Bcl-2表达水平，进而减轻HaCaT 细胞的辐射损伤，这为进一步探讨黑枸杞水提物在UVB光保护作用中的机制提供了理论基础。

作者贡献：加杨娥对文章进行构思和设计，参与大部分实验操作，撰写论文；任立汆进行文献资料的收集和整理；燕华玲进行文章的可行性分析，对论文进行修正，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔丽红)

EffectsofBlackWolfberryWaterExtractsonProliferationandApoptosisandApoptosis-related-proteinExpressionLevelofHaCaTCellsafterUVBRadiation

JIAYang-e,RENLi-cuan,YANHua-ling*

DepartmentofDermatology,QinghaiUniversityAffiliatedHospital,Xining810001,China

*Correspondingauthor:YANHua-ling,Professor,Chiefphysician;E-mail:yhlckw@163.com

ObjectiveTo research the effect of black wolfberry water extracts on proliferation and apoptosis and P38 mitogen activated protein kinase(P38MAPK), P53, cysteine proteinase 8(caspase-8), cysteine proteinase 3(caspase-3) and B cell lymphoma factor 2(Bcl-2) expression of HaCaT cells after ultraviolet B(UVB) radiation,in order to explore the mechanism of black wolfberry water extracts reducing the damage of HaCaT cells after UVB radiation.MethodsFrom March 2015 to January 2016, black wolfberry water extracts was extracted and HaCaT cells were cultured in vitro.HaCaT cells in logarithmic growth phase were collected and randomly divided into 3 groups by random number table method:control group(without radiation), UVB group(30 mJ/cm2UVB radiation for 40 min) and black wolfberry water extracts group(30 mJ/cm2UVB radiation for 40 min+black wolfberry water extracts 2 mg/ml).Cell proliferation in each group was detected by MTS, apoptotic rate in each group was assessed by flow cytometry.The expression levels of P38MAPK, P53, caspase-8, caspase-3 and Bcl-2 in each group were detected by Western blotting.ResultsCell proliferation in UVB group was lower than that in control group(P<0.05);cell proliferation in black wolfberry water extracts group was lower than that in control group but higher than that in UVB group(P<0.05).Apoptotic rate in UVB group was higher than that in control group(P<0.05);apoptotic rate in black wolfberry water extracts group was higher than that in control group but lower than that in UVB group(P<0.05).The expression levels of P38MAPK, P53, caspase-8, caspase-3 in UVB group were higher than those in control group, but the expression level of Bcl-2 in UVB group was lower than that in control group(P<0.05);the expression levels of P38MAPK, P53, caspase-8, caspase-3 in black wolfberry water extracts group were lower than those in UVB group, but the expression level of Bcl-2 in black wolfberry water extracts group was higher than that in UVB group(P<0.05).ConclusionThe black wolfberry water extracts can promote the proliferation of HaCaT cells after UVB radiation and prevent their apoptosis.The mechanism might be that the black wolfberry water extracts can down-regulate the expression levels of P38MAPK, P53, caspase-8 and caspase-3 and up-regulate the expression level of Bcl-2, so as to reduce the radiation damage of HaCaT cells.

Lycium barbarum；Ultraviolet rays；Cell proliferation；Apoptosis；P38 mitogen activated protein kinase；Tumor suppressor protein p53；Cysteine proteases；B cell lymphoma factor 2

青海省科技计划应用基础研究项目(2014-ZJ-756)

R 758.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.07.y18

2017-02-07；

2017-06-05)

810001 青海省西宁市，青海大学附属医院皮肤科

*通信作者：燕华玲，教授，主任医师；E-mail：yhlckw@163.com