紫花苜蓿苗期耐盐指标筛选及耐盐性综合评价

田小霞， 毛培春， 李杉杉， 郭 强， 孙建明， 张 琳， 孟 林*

(1. 北京市农林科学院北京草业与环境研究发展中心， 北京 100097；2. 北京克劳沃草业技术开发中心， 北京 100029)

土壤盐渍化使得土壤溶液渗透压增大[1]，土体透水性、通气性变差，养分有效性降低，影响植株的正常生长，并阻碍农林业生产发展[2-3]。因此，如何合理开发利用盐渍土资源一直是国际生物科学研究的重大课题之一。实践证明，应用生物措施改良盐渍土是有效措施之一，其中发掘更多的耐盐植物，尤其是耐盐优良牧草，既可以充分利用盐碱地发展畜牧业和现代盐土农业，又可以遏制土地退化、促进生态良性循环[4]。植物在盐分胁迫下，其形态特征、生理生化或分子机制发生一定程度的变化，但不同植物种间和不同品种间，甚至同种不同种质材料间其耐盐性都存在明显的差异[5]。因此，从现有的种质材料中筛选出耐盐性强的种质材料是植物抗逆杂交育种及基因工程育种的主要手段之一。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一种全球广泛栽培的豆科草本植物，被誉为“牧草之王”，属中等耐盐碱植物，在增加优质饲料生产、推动畜牧业发展和改良土壤中发挥了重要作用[6]。因此，选育耐盐苜蓿品种，是开发利用盐碱地的有效措施之一，其中苜蓿种质材料耐盐性的评价鉴定则是培育耐盐苜蓿品种以及研究耐盐机理的基础。目前在苜蓿耐盐品种和种质鉴定综合评价方面已有大量相关报道。AL-khatib等[7]研究表明，苜蓿苗期阶段对盐比较敏感，是耐盐鉴定的最佳时期。刘春华等[8]将69个苜蓿品种的耐盐性分为三级，刘彦等[9]对19个苜蓿品种进行了耐盐碱研究，筛选出3个耐盐性强的苜蓿品种。李源等[10-11]对19份苜蓿种质材料进行综合评价，筛选出4份耐盐性强的种质材料；以48份苜蓿种质为研究材料，采用室内盆栽法，以存活率和苗高及地上、地下植株干重等形态指标进行聚类分析，从48份材料中筛选出15份耐盐种质材料。岳明强等[6]研究表明营养液培养法是苜蓿材料苗期耐盐性鉴定的最优方法。鉴于此，本研究以48份紫花苜蓿种质为试验材料，利用多元统计分析法对盐胁迫下紫花苜蓿苗期的形态及生理指标进行耐盐性综合评价，探讨各指标与耐盐性之间的关系，筛选出耐盐性较高的种质材料，并建立紫花苜蓿种质材料苗期耐盐性预测回归模型，以期为规范、准确的苜蓿耐盐性种质资源评价及新品种选育提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为48份紫花苜蓿，其中对照(CK)为‘中苜一号’， AZ-88NDC由北京克劳沃草业技术开发中心提供，其余46份为俄罗斯引进材料，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1材料培养与处理 试验于2015年春、夏季进行。将紫花苜蓿种子用5%NaClO消毒15 min，蒸馏水冲洗数次后置于垫两层滤纸的培养皿中。发芽培养皿置于25℃恒温培养中，培养条件：光周期16 h(昼)/8 h(夜)，光强约为600 μmol·m-2s-1，相对湿度为60%～80%。发芽7 d后，挑选发芽一致的幼苗置于内径35 cm×27 cm×10.5 cm(长×宽×高)长方形无孔塑料水培盒中，盒外用锡箔纸包裹，用Hoagland营养液培养，幼苗用0.5 cm厚的聚苯乙烯泡沫板和海绵固定，水培盒每间隔3 h通气1 h，试验在北京市农林科学院日光温室进行，期间室内日平均温度(25±3)℃，平均相对湿度(60±5)%，每7 d更换一次营养液。待幼苗三叶期时开始盐处理试验，根据前期试验结果，设置5种浓度梯度：0.0%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，一次性将NaCl按试验设计加入Hoagland营养液中，每处理重复3次。胁迫处理15 d后取样，叶片相对电导率和叶绿素的测定取相同部位叶片，3次重复。

1.2.2测定指标与方法 苗高(cm)：用直尺测量植株垂直生长高度，于处理第一天和试验结束时定株测定。

生长速度(cm·d-1)=(处理结束时苗高-处理第一天苗高)/处理天数

植株干重(g)：称重法。胁迫处理结束后，取整株植株置于信封袋中，烘箱中烘干至恒重，称其干重。

绿叶数：复叶叶片绿色为2/3以上即为绿叶。

存活率(%)= (胁迫处理后存活苗数/原幼苗总数)×100%。

叶片相对电导率(%)：使用DDS-307型电导率仪测定。

叶绿素含量(mg·g-1鲜重)：直接浸提法(无水乙醇∶丙酮=1∶1溶液)。

1.3 数据分析及评价方法

1.3.1单项指标耐盐系数

(1)

1.3.2紫花苜蓿各综合指标的隶属函数值

(2)

(3)

式中：μ(Xj)表示第j个指标的隶属函数值；Xj表示第j个指标值；Xmin表示第j个指标最小值；Xmax表示第j个指标最大值，指标与耐盐性成正相关用隶属函数公式(2)计算隶属函数值，指标与耐盐性成负相关用反隶属函数公式(3)计算隶属函数值。

1.3.3各综合指标的权重

(4)

式中：Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；Vj表示经主成分分析所得各材料第j个综合指标的贡献率。

1.3.4耐盐综合评价值

(5)

式中：D值为各紫花苜蓿在盐胁迫条件下由综合指标评价所得的耐盐性综合评价值。

用Excel 2010进行数据处理，SPSS 19.0统计分析软件进行相关性分析和主成分分析，基于欧氏距离系统聚类法进行聚类分析，运用隶属函数法和主成分赋予权重法计算各种质的耐盐性综合得分，准确鉴定每份材料耐盐性。

2 结果与分析

2.1 各单项指标的耐盐系数及相关性分析

根据公式(1)计算紫花苜蓿种质材料各单项指标的耐盐系数，由表1可知，生长速度(GR)、绿叶数(NGL)、叶片叶绿素含量(Chl)、苗高(SH)、存活率(SR)、植株干重(DW)等6个指标与对照(0.0%)相比较均有所下降(ω<1)，相对电导率REC与对照相比有所增加。由表1可知，相同指标下不同材料的耐盐系数不同，不同指标下相同材料的耐盐系数也存在差异。从单项指标分析，例如，GR：48份紫花苜蓿耐盐系数范围为0.394～0.743，其中，耐盐系数大于0.7的有4份材料，M-1380耐盐系数最高；M-820材料的耐盐系数最低;REC：耐盐系数范围为1.130～3.181，M-7876，M-603材料的耐盐系数较高，值为分别为3.181，3.101，M-857，M-1380等4份材料耐盐系数较低，均低于1.2；DW：耐盐系数范围为0.430～0.878，M-785，M-809等5份材料的耐盐系数较高，均高于0.8，M-905，M-7843等7份材料的耐盐系数较低，均低于0.5。M-1380材料在GR，SH，SR指标中耐盐性表现较好，但在NGL，Chl中表现较差。M-244材料在NGL，SR，DW指标中耐盐性表现较差，但在GR和Chl指标中耐盐性表现较好。M-785材料的DW耐盐性表现最好，但在GR，NGL，Chl，GR等指标中耐盐性表现较差。

采用双变量相关性分析法对48份紫花苜蓿种质的7个指标耐盐系数进行相关性分析，由表2可知：GR与NGL，SH呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数分别为0.381，0.602，GR与Chl呈显著正相关(P<0.05)，相关系数为0.353；Chl与SH呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数为0.377；DW与SH呈显著负相关、与REC呈显著正相关(P<0.05)。说明这7项指标之间均存在不同程度相关性，因此他们所提供的信息有一定的重复性，而耐盐性是一种综合性状的表现，用单项指标来评价紫花苜蓿耐盐性具有一定片面，不能准确鉴定出供试材料的耐盐性。因此，为弥补单项指标进行耐盐性评价的不足，需要进行其他多元统计分析。

表1 各单项指标的耐盐系数ω值Table 1 ω value of saline tolerance coefficient of each indexs

表2 各单项指标的相关系数矩阵Table 2 Correlation matrix of each index

注：*表示显著相关(P<0.05)；**表示极显著相关(P<0.01)

Note：*indicate significant correlation at the 0.05 level；**indicate significant correlation at the 0.01 level

2.2 供试紫花苜蓿耐盐指标的主成分分析

通过SPSS 19.0软件对供试紫花苜蓿各指标进行主成分分析，结果如表3所示。第1主成分的贡献率是30.836%，第2主成分的贡献率为21.649%，第3主成分的贡献率为17.647%，第4主成分的贡献率为11.371%，第5主成分的贡献率为8.641%，五者累计贡献率达90.144%>85%，基本代表了供试材料各指标的绝大部分信息，其余成分可以忽略不计，因此，可以将这5个主成分用于紫花苜蓿耐盐性分析。另外，第1主成分中，SH，GR，NGL耐盐系数的特征向量较高，分别为0.572，0.513，0.406，表明在第1主成分中，这3个耐盐指标为主要的作用因子；在第2主成分中叶片Chl，SR耐盐系数的特征向量较高，分别为0.675，-0.451，表明第2主成分中这两者为主要作用因子；在第3主成分中，SR，NGL耐盐系数特征向量较高，分别为0.624，0.559，表明第3主成分中这两者为主要作用因子。

表3 供试紫花苜蓿苗期耐盐指标的主成分分析Table 3 Principal component analysis of salt tolerance indexes at seedling stage of alfalfa germplasms

2.3 供试紫花苜蓿综合指标值、权重、隶属函数值、D值、预测值及耐盐性评价

根据各单项指标耐盐系数和各综合指标的特征向量求出紫花苜蓿材料5个综合指标值，根据隶属函数公式(2)，(3)计算出相对应的隶属函数值，由权重公式(4)计算各综合指标的权重Wj。经计算，5个综合指标的权重分别为：0.342，0.240，0.196，0.126，0.096(表4)。用公式(5)计算各个紫花苜蓿材料的耐盐性综合评价值D值，并根据D值对其耐盐性进行强弱排序(表4)，其中M-1409的D值最大，表明其耐盐性最强；M-820的D值最小，表明其耐盐性最差。

表4 各材料综合指标值、权重、隶属函数值、D值、预测值及综合评价Table 4 The value of comprehensive index, index weight, subordinative function, D value, prediction and comprehensive valuation of each material

采用系统聚类法对D值进行聚类分析，可将48份材料划分为4类：M-7876，M-7856、中苜一号等11份材料为第Ⅰ类，属于强耐盐性；M-7843，M-1498，M-1457等18份材料为第Ⅱ类，属于中等耐盐性；M-871，M-1053，M-1153等10份材料为第Ⅲ类，属于弱耐盐性；M-905，M-1026，M-857等9份材料为第Ⅳ类，属于敏盐性(图1)。

图1 48份紫花苜蓿材料聚类树状图
Fig.1 The dendrogram of clusters for 48 alfalfa accessions

2.4 耐盐性鉴定中耐盐指标选择及供试材料耐盐性预测

以耐盐性综合评价D值为因变量，各单项指标耐盐系数ω做自变量，采用多元逐步回归分析法建立最优回归方程：D=-0.522+0.779GR+0.382SH+0.084REC+0.297SR，该回归方程的相关系数R=0.890，F=110.14，P=0.001，方程显著。由方程可知，在7个单项指标中，上述4个指标对耐盐性有显著影响，因此在供试材料耐盐性鉴定中可有选择地测定这4个指标来简单化耐盐性鉴定。同时可在相同条件下测定其他紫花苜蓿种质材料上述4个指标的耐盐系数，利用该方程可预测其他种质材料的耐盐性。

通过回归方程预测供试紫花苜蓿种质材料苗期耐盐性，得到耐盐性预测值(表4)，对48份材料的耐盐性综合评价值与预测值做简单相关分析可得相关系数R=0.944**，达极显著水平。说明用此回归方程对供试紫花苜蓿耐盐性进行预测效果较好。

3 讨论

不同研究者对于紫花苜蓿耐盐性鉴定材料的胁迫方法、生长时期、耐盐性鉴定指标等有不同的观点，于卓等[12]认为紫花苜蓿苗期对盐分反应较发芽期更为敏感，McCoy[13]研究发现紫花苜蓿在苗期进行耐盐性筛选评价更容易，岳明强等认为[6]营养液法与生产实践基本一致，是苜蓿材料耐盐性鉴定的最优方法；因此，本试验采用营养液培养法，选择苗期进行苜蓿种质材料的耐盐性鉴定。植物耐盐性是一个受多种因素影响的复杂数量性状，不同植物品种、不同种质资源间耐盐性存在较大差异，且耐盐性机制也不相同，从而使得不同植物品种、不同种质材料在盐胁迫条件下对某一具体指标的反应也不尽相同[14-15]。因而，用单项指标难以全面准确地反映植物品种、种质材料的耐盐能力，应用多项指标综合评价植物的耐盐性[16-17]。本试验选用较为简单、便捷、直观的7个指标进行测定，同时为消除试验材料间的固有差异，选择各指标的耐盐系数(不同浓度处理下平均值和对照的相对值)来比较材料的耐盐能力，在此基础上应用多元统计分析方法对紫花苜蓿苗期的耐盐性进行综合评价。

通过对供试紫花苜蓿种质材料7项指标的耐盐系数进行相关分析和主成分分析，将原来的7个单项指标转换成5个彼此独立的综合指标，再根据各综合指标的贡献率求出各材料每一个综合指标值[CI(x)值]及相对应的隶属函数值[μ(x)]，依据各综合指标的权重进行加权后，得到试验材料苗期耐盐性的综合评价值(D值)，比较客观地反映了各材料的耐盐能力。通过对D值聚类分析，将48份试验材料划分为强耐盐性、中等耐盐性、弱耐盐性和敏盐性4种类型。进一步利用逐步回归法建立了紫花苜蓿种质材料苗期耐盐性预测回归模型：D=-0.522+0.779GR +0.382SH +0.084REC+0.297SR，可考虑在相同的盐胁迫条件下，以植株GR，SH，REC，SR这4个指标直接运用于D值计算并进行耐盐能力评价，使苜蓿耐盐性鉴定与利用研究预测更加快速、简单，也可为抗逆性栽培、育种及种质材料的鉴定与筛选提供依据。刘妍妍等[18]比较了16个小麦(TriticumaestivumL.)品种苗期的耐盐性，指出苗高生长量可以作为小麦耐盐性的筛选指标。张耿等[19]研究表明苗高能够真实反映盐胁迫下植株的生长状况，可以直接鉴定牧草的耐盐性；吴欣明等[20]研究指出苗高指标是羊茅(FestucaovinaL.)属植物耐盐性评价中最直观有效的指标，王保平等[21]也研究指出苗高可以作为一表观指标来衡量苜蓿苗期的耐盐性。相对电导率的变化是反映植物细胞膜伤害程度的指标之一[10]，在盐胁迫逆境下，植物细胞膜通透性增加，细胞内离子和可溶物大量外渗，使得细胞膜受到不同程度的破坏，通过电导法测定植物的相对电导率，可以反映植物受伤害的程度，是检验植物受逆境胁迫后细胞膜受损伤程度的重要指标[22-23]。王运琦等[24]研究表明细胞质膜透性可以作为紫花苜蓿耐盐性评价的指标之一。谢楠等[25]研究认为将饲用黑麦(Secalecereale)、小黑麦苗期盐胁迫后的存活率作为评价指标对各试验材料进行耐盐性评价，不仅可以直接反映出各试验材料间的耐盐性强弱，而且与耐盐指数法等结果大体趋势一样，刘春华等[8]研究指出存活率可以作为评价苜蓿品种间耐盐性差异的指标。

虽然应用综合指标评价植物的耐盐性观点已被研究者广泛接受，但是怎样对多项指标综合应用且又定量的报道仍较少[15]，本文对48份紫花苜蓿种质材料的耐盐能力进行综合评价，避免了单项指标带来的片面性，且由于各种质材料的耐盐综合评价值(D值)本身是一个[0,1]闭区间的无量纲系数[14]，使得各种质材料间耐盐性的差异具有可比性。由表4可知，供试紫花苜蓿种质材料中，M-1409的综合评价值D值最大，耐盐性最强，但M-1409的5个综合指标的隶属函数值在不同综合指标的隶属函数值差异性较大，例如：在综合指标CI(5)的隶属函数值最大为1.000，而综合指标CI(3)的隶属函数值仅为0.435；而M-1380的CI(1)、M-325的CI(2)等的隶属函数值最大，均为1.000，说明紫花苜蓿种质材料不同其耐盐机制也不相同。本试验的材料为紫花苜蓿，且本试验研究预测方程和筛选耐盐指标是否适合于其他苜蓿材料的耐盐性鉴定，则有待于进一步的研究与验证。

4 结论

通过多元统计分析方法得出综合评价D值可定量得知紫花苜蓿材料的耐盐性大小。用系统聚类法对D值进行聚类分析，可将48份材料划分为4个类群：第Ⅰ类为强耐盐性：M-1409，M-325，M-7835，M-1380等11份种质材料；第Ⅱ类是中等耐盐性：M-832，M-653，M-1215，M-1445等18份种质材料；第Ⅲ类为弱耐盐性：M-712，M-7765，M-7823，M-785等10份种质材料；第Ⅳ类为敏盐性：M-1104，M-882，M-809，M-686等9份种质材料。

通过逐步回归分析方法建立了紫花苜蓿种质材料苗期耐盐性预测回归模型：D=-0.522+0.779GR+0.382SH +0.084REC+0.297SR。在相同逆境条件下，可通过测定GR，SH，REC，SR等4个指标进行材料耐盐性强弱的快速检测和预测。