长期稻-稻-油菜轮作对土壤理化性质及微生物群落结构的影响

杨敬林，李 琳，胡德勇*

(1.湖南农业大学 工学院，湖南 长沙 410128； 2.湖南师范大学 数学与计算机科学学院，湖南 长沙 410081)

长期稻-稻-油菜轮作对土壤理化性质及微生物群落结构的影响

杨敬林1，李 琳2，胡德勇1*

(1.湖南农业大学 工学院，湖南 长沙 410128； 2.湖南师范大学 数学与计算机科学学院，湖南 长沙 410081)

为探究南方丘陵地区稻-稻-油菜轮作对土壤理化性质和微生物群落结构的影响，采用常规土壤农化分析和磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法，以安仁县长期稻-稻-油菜轮作(DDY)和稻-稻连作(DD)土壤为研究对象，比较长期(30 a)DDY和DD处理后3个时期(早稻成熟期、晚稻成熟期、油菜成熟期)土壤理化性质和微生物群落结构的差异。结果表明，DDY处理土壤全氮、全磷含量及pH值均低于DD处理，其中，全氮含量在3个时期均差异显著，全钾含量增加但与DD处理差异不显著，有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量呈动态变化。轮作对土壤全氮含量影响较大，3个时期DDY处理全氮含量分别较DD处理降低50.76%、46.67%、49.62%。土壤微生物PLFA分析结果表明，与DD处理相比，DDY处理土壤微生物PLFA总量显著提高，3个时期分别提高19.69%、20.20%、49.12%，其中，DDY处理土壤细菌PLFA量显著增加，真菌PLFA量显著降低，真菌与细菌PLFA量比值显著降低。对土壤微生物PLFA进行主成分分析表明，轮作对微生物群落结构产生明显影响，2种种植方式主要影响土壤中细菌和真菌的数量。总之，长期稻-稻-油菜轮作促进了土壤全氮和全磷的分解，显著提高微生物生物量，尤其是细菌生物量，显著降低真菌生物量，提高两者的比值。

稻-稻连作； 稻-稻-油菜轮作； 土壤； 微生物群落结构

轮作是指同一块土地上有计划地按顺序轮种不同类型作物的复种形式，该栽培措施对改善土壤质地、促进作物生长和产量提高具有显著效应[1-3]。水稻和油菜之间隔茬种植在我国长江以南地区推广面积较广。作物生长除了受光照和温度等自然环境条件影响外，还受土壤因素影响。土壤中对作物生长影响较大的是养分元素和微生物。养分元素主要包括氮、磷和钾等营养元素，这些元素是植物生长过程中合成茎、叶的必需元素。微生物是作物根系与土壤之间进行各种生化反应的必要条件，例如，在微生物的作用下土壤发生硝化作用，为作物生长提供能直接吸收利用的硝态氮。轮作对作物吸收土壤养分以及土壤肥力的影响已有一些报道。蔡艳等[4]研究多种不同类型的旱地作物轮作栽培时发现,轮作提高了土壤养分供给。不同作物轮作对土壤养分的吸收利用不同，对土壤性质的影响也不同。土壤微生物与土壤养分之间存在相互作用，微生物的生长所需的碳源和相关元素来源于土壤，同时微生物又可分解土壤中有机态碳氮化合物进而增加土壤碳、氮含量[5]。水旱轮作中水稻-棉花、水稻-玉米轮作对土壤中微生物类群活性的增强、种群丰富度的提高均有显著作用[6]。相关研究表明，轮作使土壤微生物生态系统发生变化，不同作物根系释放物对土壤微生物数量和种类产生影响[7]。但是土壤中微生物数量极其庞大，应用传统的分离培养法对土壤微生物进行分析存在局限性，采用分子生物标记技术能比较全面地反映微生物的特征，并能对微生物类群进行鉴别。分子生物标记技术常用的方法是磷脂脂肪酸(PLFA)分析法，PLFA是所有活细胞细胞膜中磷脂的重要成分，且具有生物学分类中属的特异性，通过不同的生化途径可以形成不同的PLFA[8]。姚钦等[9]进行长期大豆轮作系统定位试验发现，轮作增加了土壤细菌数量，降低了真菌数量，并在一定程度上改变了土壤群落结构。目前，关于长期稻-稻-油菜轮作对土壤理化特性和微生物群落结构的影响研究鲜有报道。为此，以经过30 a长期稻-稻-油菜轮作和稻-稻连作的土壤为研究对象，检测其土壤理化性质，并采用PLFA法分析土壤微生物群落结构特征，以期为稻-稻-油菜轮作的实际应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1试验地概况

试验田位于湖南省安仁县渡口乡(26°17′N、113°27′E)，该地区属于亚热带季风气候，年均降雨量为1 000～1 400 mm，年均温度为15～17 ℃。从1986年开始一直进行稻-稻-冬闲连作和稻-稻-油菜轮作。2种种植方式的施肥量及施肥方式相同。经过30 a的定位试验，选取根际土壤进行研究。

1.2试验设计及土样采集

试验设置1 a种植2季水稻即稻-稻连作(DD)处理和1 a种植2季水稻外加冬油菜即稻-稻-油菜轮作(DDY)处理，2个处理均设3个重复。试验小区面积为3 m×8 m，每个小区之间通过起垄隔开。于2015年7月、10月和2016年4月，分别在早稻、晚稻和油菜成熟期，按随机抽样法从每个试验小区布点采集土壤样品。采样方式是将整棵水稻或油菜连根拔出后，将穴中土壤装入无菌自封袋中标记为非根际土。抖动拔出后的水稻或油菜植株根系，使附着在根际外围的土壤散落，选取根际上的土壤放入无菌自封袋标记为根际土。

1.3测定项目及方法

1.3.1 土壤基本理化性质 土壤全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷、速效钾、有机质含量及pH值参照《土壤农化分析》中的方法进行测定[10]。

1.3.2 土壤PLFA量 土壤PLFA的测定和分析参照文献[8，11]，其具体步骤如下。(1)称取5.00 g冷冻干燥的土壤样品于80 mL玻璃离心管中，离心管用铝铂纸包住遮光，依次加入4.0 mol/L柠檬酸缓冲液、5.0 mL氯仿和10.0 mL甲醇溶液(氯仿、甲醇、柠檬酸的体积可以改变，只要满足在单一相萃取中体积比为 1∶2∶0.8即可)。(2)在25 ℃条件下，120 r/min振荡2 h，然后120 r/min离心10 min，将上清液转移至125 mL分液漏斗中，并加入4.5 mL氯仿，总体积为25～30 mL，摇动分液漏斗放气，然后放置在暗处过夜。(3)将下层溶液过滤到包裹铝铂纸的茄型瓶中，然后用氯仿冲洗，氮气吹干。(4)用甲醇将样品转移到含0.5 g硅胶、上部放有金属铜粉的分析柱上。(5)依次用5 mL正乙烷、氯仿、丙酮和甲醇洗脱，将甲醇洗脱液收集到包裹铝铂纸的10 mL具塞刻度试管中。(6)加入200 μL 19:0脂肪酸甲脂内标，用氮气吹干，重新溶于1 mL甲醇和甲苯混合液(比例为1∶1)中，再加入1 mL 0.2 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，混匀，在37 ℃保持15 min。(7)冷却至室温，加入2 mL正乙烷和氯仿混合液(比例为4∶1)、0.3 mL无水乙酸溶液，混匀。最后加入2 mL去离子水，摇匀后静置分层，保留上清液。(8)再加2 mL正乙烷和氯仿混合液(比例为1∶1)到水相中，合并正乙烷，用氮气吹干，重新用去离子水定容，充氮气封口，用气相色谱仪进行分析。

根据色谱图分析，以19：0脂肪酸甲脂作内标物进行定量计算。特定脂肪酸的命名方法：脂肪酸链长以碳原子总数计算，从羧基开始，冒号后代表双键的数目，ω后代表双键的位置；c、t表示顺式和反式双键，a和i分别指反势支链和顺式支链，br表示不确定支键位置，cy表示环丙基，Me表示甲基位置。常见的微生物群落PLFA标记如表1所示[12-14]。

表1 表征微生物的PLFA

1.4数据处理

采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较，采用Origin 8.0进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1长期稻-稻-油菜轮作对土壤基本理化性质的影响

由表2可知，在3个不同测定时期，DDY处理土壤全氮含量显著低于DD处理，分别较DD处理降低50.76%、46.67%、49.62%；全磷含量和pH值也均低于DD处理，其中全磷含量仅在油菜成熟期差异显著，pH值差异均不显著；DDY处理土壤全钾含量高于DD处理，差异均不显著；DDY处理有机质含量和速效钾含量在早稻、晚稻成熟期低于DD处理，在油菜成熟期高于DD处理，其中，速效钾含量3个时期均差异显著，有机质含量在早稻成熟期差异显著；DDY处理碱解氮含量仅在晚稻成熟期高于DD处理，其余2个时期均低于DD处理，3个时期均差异显著；DDY处理速效磷含量仅在早稻成熟期高于DD处理，其余2个时期均低于DD处理，差异均显著。

土壤中全氮 、全磷、全钾含量能够反映土壤肥力的总体水平。本研究发现，轮作主要对土壤全氮含量产生影响，长期稻-稻-油菜轮作促进了土壤中全氮的分解，加快其转化使土壤中全氮含量下降；长期稻-稻-油菜轮作使土壤全磷含量下降，其中在油菜成熟期差异显著，表明轮作也能加快土壤中全磷的分解和转化使其含量下降；长期稻-稻-油菜轮作对土壤全钾含量影响较小，3个时期均差异不显著。土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量呈动态变化，其含量随作物吸收、土壤养分及有机物的分解而变化。土壤有机质含量表现为在油菜成熟期DDY处理高于DD处理，栽种油菜会提高土壤有机质含量，这可能与油菜落叶有关，油菜成熟后叶片凋落在土壤中，凋落物的分解提高了土壤有机质含量。pH值反映土壤的酸碱度，长期的轮作栽培会使土壤中的pH值降低。

表2 长期稻-稻-油菜轮作对土壤基本理化性质的影响

注：同列数据后不同字母表示处理之间差异显著(P<0.05)。

2.2长期稻-稻-油菜轮作对土壤微生物生物量的影响

土壤微生物PLFA总量反映土壤微生物的生物量。从图1可知，3个时期，DDY处理PLFA总量均显著高于DD处理，分别较DD处理提高19.69%、20.20%、49.12%，表明冬季栽种油菜较冬闲田更能有效保持土壤微生物数量及种群结构的稳定，这是因为土壤中微生物生长繁殖除了利用土壤中有机质分解产生的碳源和氮源外，根系分泌物也是一类重要的可利用物质来源。DDY处理增加了土壤中的根系分泌物，为微生物生长提供更多的物质源。

不同字母表示处理之间差异显著(P<0.05)，下同图1 长期稻-稻-油菜轮作对土壤微生物PLFA总量的影响

土壤中微生物主要由细菌、真菌及一些原生动物和微藻类组成，其中细菌和真菌对作物生长影响较大。由图2—3可知，3个时期，DDY处理细菌PLFA量均显著高于DD处理，分别较DD处理提高30.43%、31.42%、22.67%，而真菌PLFA量均显著低于DD处理，分别较DD处理降低13.56%、27.17%、12.21%，表明DDY处理能有效提高土壤细菌生物量，降低真菌生物量。由图4可知，DDY处理土壤真菌PLFA量与细菌PLFA量比值显著低于DD处理，3个时期分别降低33.73%、44.58%、25.75%，表明稻-稻-油菜轮作能够有效降低土壤中真菌在微生物中所占的比例，提高细菌所占比例，这可能是因为轮作条件下不同种类真菌之间会存在一些生物拮抗作用而使其数量下降；连作栽培有利于真菌在土壤中的积累。

图2 长期稻-稻-油菜轮作对土壤细菌PLFA量的影响

图3 长期稻-稻-油菜轮作对土壤真菌PLFA量的影响

图4 长期稻-稻-油菜轮作对土壤真菌与细菌PLFA量比值的影响

2.3长期稻-稻-油菜轮作对土壤微生物群落结构的影响

本研究测定了土壤PLFA同类标记物含量，根据测定结果对DDY处理和DD处理土壤PLFA同类标记物含量进行主成分分析。如图5所示，第一主成分(PC1)贡献率为59.26%，第二主成分(PC2)贡献率为28.33%，这2个主成分的累积贡献率达87.59%，累积贡献率超过了85%，能基本解释数据的变异情况。DDY处理数据分布点主要落在PC1轴和PC2轴的正方向上，而DD处理数据分布点主要落在PC1轴和PC2轴的负方向上。数据点之间距离表示PLFA检测出的微生物类别相近度，不同处理组数据分布点在PC轴上差异明显，说明不同种植处理形成了不同的微生物类别组成。图中的散点分布显示，DDY处理和DD处理间隔较远，相同处理的土壤PLFA同类标记物主成分分析散点较为集中。PLFA同类标记物主成分分析结果说明，轮作对微生物群落结构产生了明显影响，同类种植模式土壤中微生物群落结构相似。

图5 不同处理土壤微生物PLFA主成分分析

为进一步分析不同种植方式土壤微生物群落结构的差异，对DDY处理和DD处理土壤样品测出的20种典型PLFA进行主成分分析，以3个时期测定的相同类标记物含量平均值进行微生物群落载荷因子分析。由图6可知，对第一主成分起主要作用的是i16：0、16：1ω5、i17：0、i18：1ω5、18：2ω6、18：1ω9，对

第二主成分起主要作用的是10Me16：0、10Me17：0、cy17：0、i17：1ω7、20：3ω6。第一主成分主要由细菌和真菌构成，第二主成分主要由真菌和放线菌构成。通过PLFA标记的这几类微生物属于土壤中的优势菌种，其含量越高对主成分贡献越大。每类微生物的特定PLFA在主成分中的分布表明，DDY处理和DD处理土壤中的微生物类型以细菌为主，其次是真菌。

图6 不同处理土壤微生物PLFA主成分因子载荷

3 结论与讨论

土壤中微生物的数量及其类别非常复杂，但每类微生物都有特定的PLFA，通过典型的PLFA标记法测定土壤中微生物的属类和生物量，可以分析土壤微生物的群落结构[12]。PLFA是20世纪七八十年代发展起来的微生物测定技术，该技术可以对土壤中微生物进行定量分析并鉴定微生物类别。PLFA可以分析土壤中微生物的生物量和各类优势菌群落结构，相比传统分离培养方法，具有分析全面、结果稳定和准确性不易受外界环境中微生物感染影响等优势[13-15]。陈晓娟等[16]应用PLFA分析法研究不同耕地利用方式对土壤微生物各群落生物量的影响发现，水旱轮作改善了土壤通气性，真菌/细菌比值低于稻田和旱地连作。本研究应用PLFA分析法对DDY和DD处理土壤微生物群落结构进行分析发现，在早稻成熟期、晚稻成熟期、油菜成熟期3个时期， DDY处理土壤微生物PLFA总量较DD处理分别显著提高19.69%、20.20%、49.12%，其中DDY处理土壤细菌PLFA量显著增加，真菌PLFA量显著降低，真菌与细菌PLFA量比值显著降低，这与陈晓娟等[16]的研究结果有相似之处。另外，对土壤微生物PLFA进行主成分分析表明，轮作对微生物群落结构产生明显影响，影响较大的是细菌，其次是真菌。水稻油菜轮作土壤中的细菌数量明显高于水稻连作土壤，但其真菌数量也明显少于水稻连作土壤。这与邵俊[17]研究不同农业利用下武汉狮子山土壤微生物多样性的结论是一致的。

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Effects of Long Term Rice-rice-rape Rotation on Soil Physicochemical Properties and Microbial Community Structure

YANG Jinglin1，LI Lin2，HU Deyong1*

(1.Engineering College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China； 2.College of Mathematics and Computer Science,Hunan Normal University,Changsha 410081,China)

To explore the effect of rice-rice-rape rotation on soil physicochemical properties and microbial community structure in hilly area of southern China,the soil microbial biomass and composition of two kinds of different tillage systems[long rice-rice-rape rotation(DDY) and rice-rice continuous cropping(DD)] after 30 years of rotation were analyzed by PLFA marker spectrum analysis method,and the soil physicochemical properties during three periods(including the mature stages of early rice,late rice and oilseed rape) were studied.The results showed that compared with DD treatment,the contents of total N and total P and pH value of DDY treatment decreased,there was a significant defference for total N content,the total N content of DDY treatment significantly decreased by 50.76%,46.67%,49.62%;the total K content of DDY treatment increased,but the difference was not significant;the contents of organic matter,alkali-hydrolyzable N,available P,available K showed dynamic changes.Soil microbial PLFA marker test showed that compared with DD treatment,soil microbial PLFA amount of DDY treatment increased by 19.69%,20.20% and 49.12% at three different determination stages,respectively;the bacterial PLFA amount of DDY treatment increased,the fungi PLFA amount of DDY treatment decreased,and the ratio of fungi PLFA amount to bacteria PLFA amount of DDY treatment decreased.The principal component analysis of microbial PLFA showed that rotation obviously influenced the microbial community structure,the amount of bacteria and fungi were mainly affected by two tillage methods.Overall,the long term rice-rice-rape rotation promoted the decomposition of total N and P,significantly improved the microbial biomass,especialy bacteria,significantly decreased the fungal biomass,significantly increased the ratio of bacteria to fungi.

rice-rice continuous cropping; rice-rice-rape rotation; soil; microbial community structure

2017-04-10

国家自然科学基金项目(31401951)

杨敬林(1978-)，男，湖南邵阳人，讲师，硕士，主要从事土壤资源环境方面的研究。E-mail：53835490@qq.com

*通讯作者：胡德勇(1980-)，男，湖南常德人，副教授，博士，主要从事农业环境科学与节水灌溉技术研究。 E-mail：hdy9609@hunau.net

S154.3

： A

： 1004-3268(2017)09-0045-06