PMP柱前衍生化-HPLC法分析玛咖多糖的单糖组成

陈燕文，李玉娟，宋梦璐，崔耀天，许方雪，李佳，胡晶红*，张永清*



PMP柱前衍生化-HPLC法分析玛咖多糖的单糖组成

陈燕文1,2，李玉娟1,2，宋梦璐1，崔耀天1，许方雪1，李佳1,2，胡晶红1,2*，张永清1,2*

（1. 山东中医药大学 药学院，山东济南 2503552； 2. 山东省中药材良种选育工程技术研究中心，山东济南 250355）

应用水提醇沉法获得玛咖多糖，苯酚-硫酸法测定玛咖多糖含量，PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生法对酸水解的玛咖多糖衍生化，HPLC法分析其单糖组成。结果表明，PMP柱前衍生化-HPLC法精密度、稳定性和重现性实验的相对标准偏差均小于3%，线性实验结果显示在1.50～650.00 μg/mL浓度范围内各单糖的相关系数均大于0.999 1，加样回收实验各单糖的回收率均在98.83%～102.82% 之间，确定玛咖多糖的单糖组成及摩尔比为(D-甘露糖)：(葡萄糖)：（D-半乳糖）：（阿拉伯糖）=1:196:6:6。该方法分析玛咖多糖单糖组成简单易行，结果稳定可靠。

玛咖；多糖；单糖组成；PMP柱前衍生化；高效液相色谱法

玛咖（）为十字花科独行菜属植物玛咖的块状根茎[1]，原产于南美安第斯山区秘鲁境内，现在北美洲、欧洲和东亚地区均有种植。玛咖为一种“药食同源”类植物具有悠久的应用历史，素有“南美人参”之称，营养成分丰富，富含蛋白质、生物碱、多糖、芥子油苷、类固醇、氨基酸、脂肪酸、纤维素、碳水化合物及矿物元素，此外还独有玛咖烯、玛咖酰胺等成分[2-4]。现代药理实验研究表明，玛咖具有增强生育能力、改善性功能、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、抗焦虑、抗应激及调节内分泌等功能[5-7]。玛咖多糖是玛咖有效成分中最丰富的一种，约占其有效成分总量的46.63%[8]。多糖是生物体内非常重要的一类有机化合物，除参与生物体的构造，作为能源物质、细胞识别的信息分子外，还参与体内物质转化代谢生成为生物体必须的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等。此外，药理研究表明多糖还具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等[9-11]功效。然而目前对多糖的研究却十分有限，主要原因为多糖种类繁多，结构复杂，异构体多样，且存在微观不均一性。为了的充分开发利用玛咖多糖，本文在已有文献报道的基础上[12-13]，首次应用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生化-HPLC法对提取精制所得玛咖多糖的单糖组成进行分析，以期获得一个稳定的测定玛咖多糖中单糖组成的方法，为玛咖保健品、药品、化妆品的开发、申报提供可靠的理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，2998 PDA 检测器（美国沃特世公司）；UV5100B型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；5810R台式高速大容量冷冻离心机（德国艾本德股份有限公司）；德国ALPHA1-4 LD plus冷冻干燥机（上海汇分电子科技有限公司）；GFL-230型恒温干燥箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）；LD-Y500A高速万能粉碎机（上海丁帅电热有限公司）；CP225D型十万分之一电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）等。

1.2 药材与试剂

玛咖于2016年8月购自安徽亳州药材市场，经山东中医药大学李佳教授鉴定为十字花科植物玛咖的干燥块根；葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、阿拉伯糖标准品、PMP购自上海麦克林生化科技有限公司，均为分析纯，纯度大于等于98%；乙腈为色谱纯；甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、三氟乙酸、氯仿、浓盐酸、浓硫酸、苯酚、磷酸氢二钾、氢氧化钠均为分析纯；去离子水为自制。

2 方法

2.1 多糖的提取与纯化

取干燥玛咖，粉碎，过40目筛，准确称取100.0 g依次与20倍量的丙酮、乙醇进行水浴回流提取，每次2 h，除去其低极性脂溶性成分，过滤。滤渣加入20倍量的蒸馏水，于80 ℃水浴回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液浓缩至一定程度，加入无水乙醇使醇浓度达80%（v/v），4 ℃条件下静置过夜，沉淀析出多糖，多糖用乙醇、丙酮各洗涤3次，收集沉淀，干燥得玛咖粗多糖。取玛咖粗多糖用10倍量的蒸馏水溶解，按玛咖粗多糖100:1（m/m）的比例加入木果蛋白酶，于50 ℃条件下水浴酶解2.5 h，8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，应用Sevage法萃取多次除蛋白质，至水相和氯仿相之间不再出现白色絮状物。弃氯仿相，水相加入适量体积分数为20%的H2O2室温条件下脱色过夜，再次加入乙醇至醇浓度达80%（v/v），4 ℃条件下静置过夜，抽滤，收集多糖沉淀，沉淀分别用丙酮和石油醚洗涤3次，冷冻干燥，得玛咖多糖，备用。

2.2 玛咖多糖的含量测定

2.2.1 标准曲线的制备

精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品5 mg，置于100 mL容量瓶，溶解稀释至刻度线，配制成浓度为0.05 mg/mL的标准品溶液。精密吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL标准品溶液，加入蒸馏水至2 mL后，分别加入1 mL质量分数 5%苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，于50 ℃下水浴反应15 min，以蒸馏水做空白对照，进行光谱扫描，于波长490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，计算线性回归方程。

2.2.2 玛咖多糖样品含量的测定

精密称取一定量的2.1下的玛咖多糖10 mg，置于100 mL容量瓶中，按照2.2.1下方法进行测定，代入线性回归方程，平行3次试验，计算得到样品纯度。

2.3 PMP柱前衍生化-HPLC法检测玛咖多糖的单糖组成

2.3.1 HPLC色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：250 nm；流速：0.8 mL/min；进样体积：20 μL；流动相：0.5%磷酸盐（KH2PO4-NaOH，pH= 6.8），缓冲液：乙腈，体积比77 : 23，等度洗脱。

2.3.2 标准品的制备

取100 μL混合标准液（D-甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖标准品的水溶液浓度均为1 mg/mL）与100 μL的0.6 mol/L的氢氧化钠溶液混匀后，精密吸取50 μL的混合液与50 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液均匀混合，于70℃烘箱中反应120 min，取出，冷却至室温，加入50 μL的0.3 mol/L的盐酸中和过量的氢氧化钠至pH=7，加水稀释至1 mL，再加入等体积的氯仿溶液，充分涡旋，4 000 r/min离心10 min弃氯仿层，萃取3次，加水定容至2 mL，过0.45 μm微孔滤膜，进行HPLC分析。

2.3.3 供试品的制备

准确称取玛咖粗多糖30 mg置于安瓿瓶中，加入4 mol/L的三氟乙酸溶液5 mL，混匀、封口，放入烘箱中于120 ℃条件下水解4 h，冷却至室温，向其加入5 mL甲醇，氮气吹干，重复3~4次以除去多余的三氟乙酸，然后用0.3 mol/L的氢氧化钠溶液溶解，定容至10 mL容量瓶中，得玛咖多糖水解液。水解液按照2.3.2项下方法进行衍生化操作。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

分别配制系列浓度的各单糖标准品溶液，按照2.3.2项下操作衍生化，进样进行HPLC分析，以峰面积和单糖浓度计算各单糖组分的线性回归方程，实验结果见表1。各单糖在浓度为1.50～650.00 μg/mL的回归方程相关系数均大于0.999 1，说明在此浓度范围内线性关系良好。

表1 各单糖线性方程和线性范围

2.4.2 精密度实验

精密吸取2.3.2中的标准品溶液20 μL，连续进样6次，分别计算HPLC图谱中各单糖对应色谱峰面积，得到对照品的日内精密度。连续测定5 d相同条件下的日间峰面积精密度，结果显示，各单糖的日内相对标准偏差在1.06%～2.27%。日间相对标准偏差在1.31%～2.65%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性实验

精密吸取2.3.3中的供试品溶液20 μL，依次在衍生化反应后0、3、6、9、12、15 h进样，通过HPLC测定供试品的峰面积，计算得到各单糖的相对标准偏差在1.54%～1.98%。说明各单糖的衍生物在15 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性实验

将供试品按照上述2.3.3方法平行实验6次，分别进行HPLC测定，确定6份供试品溶液峰面积，计算得到各单糖衍生物的相对标准偏差在0.98%～1.41%之间，进行比较得出相似度可达99%以上，表明该方法重现性良好。

2.4.5 加样回收实验

准确称取6份玛咖多糖样品，按照2.3.3项下操作进行水解，然后加入相应量的各单糖标准品，再按2.3.2项下操作方法衍生化后进行HPLC检测分析，测得数据代入上述标准曲线，对样品中的单糖进行计算，实验结果见表2。

表2 回收率实验结果（n=3）

3 结 果

3.1 标准曲线的制备及样品含量测定

根据2.2.1项下操作，测得各浓度下葡萄糖标准品的吸光度，以吸光度和浓度为参数计算得到线性回归方程：=47.96+0.0021，R=0.9983（在0.002 5～0.012 5 mg/mL的浓度范围内，见图1）。根据2.2.2项下操作测定玛咖多糖纯度，3次实验结果依次为82.8%、85.7%和86.2%。每次实验结果均大于80%，平均纯度为84.9%，说明本实验提取纯化玛咖多糖的方法是可靠的。

3.2 HPLC法测定玛咖多糖的单糖组成

3.2.1 标准单糖的HPLC色谱图

根据2.3.2项下操作，将混合单糖的衍生化标准品进行HPLC分析，实验结果见图2。

图1 标准品制备的标准曲线

3.2.2 玛咖多糖水解后衍生化产物的HPLC分析色谱图

根据2.3.3项下操作，多次实验提取纯化所得的玛咖多糖进行PMP柱前衍生化-HPLC分析，玛咖多糖的单糖组成结果见图3。

图2 标准单糖的HPLC色谱图

1 PMP； 2 D-甘露糖； 3 葡萄糖； 4 D-半乳糖； 5 阿拉伯糖

1 PMP； 2 D-甘露糖； 3 葡萄糖； 4 D-半乳糖； 5 阿拉伯糖； a 、b为未知成分

根据混标单糖的峰面积与浓度的关系，引入响应因子的概念，将D-半乳糖的响应因子设为1，计算其他单糖的响应因子。确定D-甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖的响应因子如表3所示。

表3 HPLC各单糖衍生物保留时间和响应因子

由各单糖衍生物的HPLC色谱图中测得的峰面积和各单糖标准品的响应因子计算得到玛咖多糖衍生物的各成分相对摩尔比，依次为（D-甘露糖）∶（葡萄糖）∶（D-半乳糖）∶（阿拉伯糖）=1∶196∶6∶6。由此可知，PMP柱前衍生化-HPLC法测定玛咖多糖是以葡萄糖为主的杂多糖。

4 讨论

本实验采用水提醇沉法对玛咖多糖进行提取，应用木瓜蛋白酶和Savage法联合除蛋白，过氧化氢脱色，丙酮和石油醚洗涤除脂溶性杂质，结果得到纯度大于80%的玛咖多糖。应用三氟乙酸水解玛咖多糖，PMP柱前衍生化-HPLC法对玛咖多糖的单糖组成进行分析。方法学考察实验结果得出PMP柱前衍生化-HPLC法分析玛咖多糖中单糖组成稳定、可靠。其中，精密度、稳定性和重现性实验的相对标准偏差均小于3%，线性实验结果显示在1.50～650.00 μg/mL浓度范围内各单糖的相关系数均大于0.999 1，加样回收实验中各单糖的回收率均在98.83%～102.82%之间。在对各标准单糖的选择过程中考虑到D、L构型单糖的差异仅在于两者的旋光性不同，在HPLC分析时两者保留时间并没有差异，故没有选择所有已知构型的单糖。对玛咖多糖单糖组成分析得出玛咖多糖主要是以葡萄为主的杂多糖，其单糖组成及摩尔比为(D-甘露糖) ∶(葡萄糖)：（D-半乳糖）：（阿拉伯糖）=1∶196∶6∶6。

对玛咖多糖的单糖组成已有多人进行研究报道。柳志宇[12]通过HPLC法应用示差折光检测器对丽江产不同品种玛咖的多糖组成进行分析，得出不同品种的玛咖多糖单糖组成不同。该研究为直接对水解后的玛咖多糖进行分析，由于糖类是一种多羟基化合物，水解后的单糖分子间很容易形成分子内氢键，极性较大，增加了各种单糖间的分离难度，影响多糖中单糖组成的定性、定量。王金全[13]通过离子交换树脂和葡聚糖凝胶纯化玛咖多糖，乙酰基化法对各种单糖进行衍生化，然后通过气相色谱法，以肌醇为内标物采用内标法进行玛咖多糖的单糖组成的分析与测定，确定其主要含有鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和一未知组成。但此方法乙酰基化过程操作繁琐，反应时间长，温度高，需要醋酸酐、吡啶等易爆、高毒性试剂，限制了实验的进一步推广，另外GC分析法还存在挥发性限制的问题[14]。本研究首次采用PMP柱前衍生化-HPLC法对玛咖多糖进行分析，PMP衍生化相对于乙酰基化过程，衍生化进行完全，操作简单，耗时短；采用二极管阵列检测器对玛咖多糖单糖组成进行检测，相对于示差折光检测器，此检测器具有灵敏度高、检测线低等优点。综上所述，PMP柱前衍生化-HPLC法分析玛咖多糖中单糖的组成操作简单易行，结果稳定可靠，值得推广。

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Analysis on Monosaccharide Composition of Maca Polysaccharide by PMP Pre-column Derivatization-HPLC

1,2,1,1,1,1,1,2,1,2,1,2

(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Shandong Jinan 250355, China; 2. Research Center of Breeding Technology of Chinese Medicinal Materials in Shandong Province, Shandong Jinan 250355, China )

To study the composition of maca polysaccharides by PMP (1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolone) pre-column derivatization and HPLC, maca polysaccharides were extracted by the method of water extraction and alcohol precipitation and measured by phenol-sulfuric acid method, derivatization of acid-hydrolyzed maca polysaccharide was carried out by pre-column derivatization of PMP, and its monosaccharides composition was analyzed by HPLC method. The relative standard deviations of precision test, stability test and reproducibility test were less than 3%, the correlation coefficient of each monosaccharide in the concentration range of 1.50～650.00 μg/mL was more than 0.999 1, and the recoveries of the monosaccharides were between 98.83%～102.82%. The composition and proportion of monosaccharide of maca polysaccharide were(D-mannose):(glucose):(D-galactose):(arabinose)= 1: 196: 6: 6. The PMP pre-column derivatization-HPLC method is simple and easy to determine the composition of the monosaccharides of maca.

Maca; Polysaccharide; Monosaccharide composition; PMP pre-column derivatization; HPLC

O 657

A

1671-0460（2017）08-1513-04

山东省重点研发计划项目(2015GSF119004)；山东省科技发展计划项目“山东道地药材资源质量控制科技平台建设”课题（2008GG2NS02022）；山东省现代农业产业技术体系中草药产业创新团队建设项目(2015)；山东省高等学校科技计划项目(J15LM55)。

2017-06-14

陈燕文（1990-），男，山东菏泽人，硕士研究生在读，研究方向：中药资源及质量控制研究。E-mail：18765804058@126.com。

胡晶红（1974-），女，山东济南人，博士，讲师，研究方向：中药资源及其质量控制研究。E-mail：hujinghong97@126.com。张永清（1962-），男，山东平邑人，博士，教授，研究方向：中药资源及其质量控制研究。E-mail：zyq622003@126.com。