小鼠pMSV-Slfn5-GFP 表达质粒构建及基因结构分析*

况春燕,杨 藩

(1.贵州省人民医院心内科，贵阳 550002； 2.西北农林科技大学动物医学院/陕西省干细胞工程技术研究中心，陕西杨凌 712100)

论著·基础研究

小鼠pMSV-Slfn5-GFP 表达质粒构建及基因结构分析*

况春燕1,杨 藩2

(1.贵州省人民医院心内科，贵阳 550002； 2.西北农林科技大学动物医学院/陕西省干细胞工程技术研究中心，陕西杨凌 712100)

目的 构建小鼠pMSV-Slfn5-GFP 基因重组表达质粒及基因结构分析。方法 提取小鼠肝脏组织中总RNA，反转录为cDNA。PCR扩增小鼠Slfn5编码序列片段,并与pGEM-T Easy载体连接,连接产物转化到大肠埃希菌DH5α中。挑取阳性克隆提取质粒，经限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒送Macrogen USA测序。测序正确的质粒通过HindⅢ和XhoⅠ与pMSV-GFP连接,并命名为pMSV-Slfn5-GFP。通过UCSC(http://genome.ucsc.Edu/) 分析小鼠Slfn5及其家族基因组结构，并通过NCBI确定Slfn5的蛋白结构域。结果 Slfn5全长基因序列克隆到表达载体pMSV-GFP中，酶切鉴定片段大小为2.65 kb。Slfn5的AAA_4蛋白结构域由phylogeny.fr确定了该结构在Slfn蛋白家族中的保守性。结论 成功构建了小鼠pMSV-Slfn5-GFP全长基因表达载体。

pMSV-Slfn5-GFP；构建；基因结构；分析

睡眠因子(Schlafen,Slfn)基因家族是近年来发现的一类新的细胞周期调节基因，该家族基因在小鼠中由10个成员组成(Slfn1、1L、2、3、4、5、8、9、10和14)[1-2]。Slfn5 是Slfn家族第三组的成员之一，它可影响多种细胞的生物学行为，但在不同的细胞中，其作用不同：(1)在NIH 3T3成纤维细胞中，通过异源性过表达Slfn5基因，结果发现成纤维细胞的生长并未受到影响[3]；(2)在人类恶性黑色素瘤细胞中，通过基因干扰的方法沉默Slfn5的表达，结果显示其有双重的作用，不仅促进恶性黑色素瘤细胞的不依赖支持物的生长和克隆形成能力，而且还增强该细胞在三维胶原中的侵袭能力[4]；笔者的前期研究，分离培养5～7 d的大鼠骨髓源性内皮祖细胞，通过RT-PCR检测Slfn5基因的表达，结果发现在EPCs细胞有Slfn5基因的表达，是否 Slfn5基因影响内皮祖细胞的功能，目前仍不清楚。为了研究Slfn5基因对内皮祖细胞功能的影响，需要构建Slfn5基因的表达载体，本文获得小鼠Slfn5全长基因表达质粒并对其基因的结构进行分析，为进一步探讨其在内皮祖细胞的生物学作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠埃希菌DH5α，质粒pMSV-GFP、反转录病毒包装细胞Plat-E、小鼠293细胞由西奈山医学院遗传系实验室提供。载体pGEM-T Easy均购自Promega公司。总RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA marker均购自天根公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、反转录试剂盒和Taq 聚合酶均购自Fermentas公司；高保真DNA聚合(PhantaTMHS Super-Fidelity DNA Polymerase)购自Vazyme公司；定量PCR Mix (Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture)购自Bioteke公司；脂质体 (Lipofectamine 2000)、Opti-MEM和DMEM培养基均购自Invitrogen公司；非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glu)、β-巯基乙醇 (β-ME) 购自Gibco 公司；胎牛血清(FBS) 购自Hyclone公司；PCR 引物由美国Macrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Slfn5编码序列的克隆与载体构建 参照天根的血液/细胞/组织基因组RNA提取试剂盒从小鼠肝脏组织中提取总RNA。从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中下载小鼠Slfn5编码序列(CDS)并设计带有酶切位点HpaⅠ和XhoⅠ的上下游引物,引物序列为Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA,并扩增2.7 kb CDS片段。产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，并与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化到大肠埃希菌DH5α中。挑取阳性克隆提取质粒，经限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒送美国Macrogen公司测序。测序正确的质粒通过HindⅢ和XhoⅠ与pMSV-GFP连接,并命名为pMSV-Slfn5-GFP。引物序列为Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA。

1.2.2 细胞培养与感染 Plat-E和293细胞用含有10% FBS的DMEM培养液，在37 ℃、含有5% CO2的细胞培养箱内培养。按照Lipofectine 2000使用说明书，首先将pMSV-Slfn5-GFP 转入Plat-E细胞，转染后18 h在换成新鲜培养液。并在转染后48、72、96 h收取细胞培养液中上清液存放于4 ℃冰箱中。将收集的培养液上清液用45 nm的滤器过滤并按照上清液与细胞培养液1∶1的比例感染小鼠内皮祖细胞，并在感染12 h后换液。为了提高感染效率将在换液后12 h进行第2次感染并换液。

1.2.3 荧光定量PCR 按照天根总RNA提取试剂盒说明书提取组织总RNA，按照RevertAidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit 相关说明进行反转录获得cDNA，并设计qSlfn和qGAPDH引物。荧光定量PCR 反应体系如下：2×SYBR Green Mix 10 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各0.5 μL (10 pmol/L)，模板 cDNA 1 μL，去离子水7 μL，共20 μL。每个样本设3个重复。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃退火阶段收集荧光信号。实时荧光定量PCR引物序列Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA。

1.2.4 小鼠Slfn5编码序列克隆及生物学分析 本研究通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因组结构，并通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)确定Slfn5的AAA_4蛋白结构域。

2 结 果

2.1 Slfn基因簇结构分析 通过对小鼠Slfn家族基因在基因组中的定位分析发现，10个Slfn基因成簇分布于11Qc,且长度约为1 mbp(82.95～83.30 mbp)。这其中包含了2个非编码基因Slfn5os和假基因Slfn10-ps。Slfn5os(Schlafen 5,opposite strand)是位于对应链上的Slfn5序列， Slfn5位于Slfn5os下游(图1A)。蛋白序列分析发现， Slfn5编码884个氨基酸且含有4个保守的结构域。其中的AAA-4结构域位于第188和320氨基酸之间。该结构域在Slfn家族中很保守(图1B)。进一步对Slfn家族全长蛋白序列分析发现Slfn5蛋白与Slfn1、Slfn3、Slfn4和Slfn2同源性较高，但是与Slfn8和Slfn9差异较大。

A：Slfn相关基因在第11号染色体上的额定位。B：Slfn蛋白及AAA_4结构域在Slfn家族蛋白中的同源比对

图1 Slfn基因结构分析

2.2 Slfn5组织表达分析 通过对小鼠序列表达标签(EST)分析发现,小鼠Slfn5表达具有组织特异性。具体来说神经组织和腺体高表达Slfn5(图2A)。通过设计针对Slfn5全序列的特异引物，成功从腺体组织中扩增得到Slfn5(图2B)。

A：Slfn5序列表达标签分布分析；B：Slfn5在腺体组织中的表达检测(1、2表示腺体组织)

图2 Slfn5组织表达分析

2.3 Slfn5表达载体构建 将扩增得到Slfn5通过酶切插入到pMSV-GFP逆转录病毒载体中(图3A)。双酶切鉴定发现成功地将2.65 kb的序列成功插入到了目标载体(图3B)。

A：Slfn5通过酶切插入到pMSV-GFP逆转录病毒载体中；B:双酶切鉴定发现将2.65 kb的序列成功插入到目标载体

图3 pMSV-Slfn5-GFP表达载体构建

2.4 Slfn5基因结构分析 本研究通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因组结构，并通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 确定了Slfn5的AAA_4蛋白结构域由phylogeny.fr(http://www.phylogeny.fr/)确定了该结构在Slfn蛋白家族中的保守性。

3 讨 论

本研究有3个发现：(1)成功构建小鼠Slfn5表达载体；(2)发现Slfn5在神经组织及腺体组织中有高表达；(3)Slfn基因簇结构分析发现Slfn5编码884个氨基酸且含有4个保守的结构域，其中Slfn5的AAA_4蛋白结构域由phylogeny.fr确定了该结构在Slfn蛋白家族中的保守性。

Slfn基因家族尽管包含了许多成员，但在不同的物种之间，各个成员的表达不同,其作用也不尽相同。是否Slfn家族在小鼠及人类有相同的功能或其功能有物种的专一性，目前仍不清楚。几个小鼠的Slfn基因，包括Slfn1、Slfn2、Slfn3在细胞增殖和分化上发挥关键的调节作用[5-7],Slfn2在免疫细胞静止状态下发挥重要作用[8]，而Slfn4参与髓细胞生成的调控[9]。Slfn5在小鼠及人类有表达[1-2]。人类Slfn5包含有一个RNA/DNA解链酶基序，而在Slfn组1成员中未见此结构[10]。有研究报道，Slfn5在干扰素诱导下,在人类的黑色素瘤细胞及肾癌细胞内表达，并且负性调节人类恶性黑色素瘤细胞的生长和侵袭能力[4],而在鼠类的恶性黑色素瘤细胞并无类似的作用[11]。此外，Slfn5参与肾癌细胞的运动及侵袭能力的调控，并且Slfn5的表达与肾癌患者的存活呈正相关[12]。目前，Slfn5的组织表达特异性及其是否参与血管细胞的生物学行为的调控，目前均少见报道。

笔者的前期研究发现，Slfn5在小鼠的内皮祖细胞有表达，为了研究Slfn5是否调节内皮祖细胞的生物学行为，本研究设计构建了小鼠Slfn5的表达载体。本实验通过获得小鼠Slfn5的全长基因，为研究Slfn5在小鼠的功能提供新的可靠依据。本研究从小鼠肝脏组织中提取了总RNA，并将其进行反转录获得cDNA,并设计带有酶切位点HpaⅠ和XhoⅠ的上下游引物,利用引物从cDNA中扩增出Slfn5的全长2.65 kb的基因序列，并与pGEM-T Easy载体连接，经转化到大肠埃希菌DH5α中形成克隆后，挑取阳性克隆进行双酶切鉴定。鉴定正确的质粒进行测序,经过测序发现得到的Slfn5与网上公布的序列NM_183201一致。测序正确的质粒通过HindⅢ和XhoⅠ与pMSV-GFP连接,质粒构建成功。同时,也通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因组结构，并通过NCBI分析Slfn5的AAA_4蛋白结构域由phylogeny.fr(http://www.phylogeny.fr/)确定了该结构在Slfn蛋白家族中的保守性。Slfn5组织表达分析。此外，还通过对小鼠EST分析发现,小鼠Slfn5表达具有组织特异性,其在神经组织及腺体组织高表达，通过设计Slfn5全序列的特异引物，成功从腺体组织中扩增得到Slfn5。目前，国际上对Slfn5的作用研究极其有限，通过本实验获得Slfn5的全长基因系列，并对其结构及其组织表达进行分析，可为进一步研究其在血管系统及神经组织及腺体组织中的生物学效应打下坚实的基础。

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Construction of pMSV-Slfn5-GFP plasmid and analysis of gene structure in mice*

KuangChunyan1,YangFan2

(1.DepartmentofCardioloy,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;2.ShaanxiProvincialCenterforStemCellsEngineeringandTechnologyResearch,CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestAgricultureandForestScienceandTechnologyUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Objective To perform mouse pMSV-Slfn5-GFP gene recombinant expression plasmid construction and gene structure analysis.Methods Total RNA was extracted from mouse liver and turned into cDNA by reverse transcription.Mouse Slfn5 coding sequence (CDS) fragment was amplified by PCR and connected with the pGEM-T Easy vector.The connected product was transferred the E.coli DH5α.The positive clones were selected for extracting plasmid,which was identified by double enzyme of restriction endonucleaseHpaⅠ andXhoⅠ.Then correct plasmid identified by enzyme digestion was sequenced by Macrogen USA.Then correct plasmid by sequencing was connected with pMSV-GFP byHindⅢ andXboⅠ,which was named as pMSV-Slfn5-GF.UCSC (http://genome.ucsc.Edu /) was used to analyze mouse Slfn5 and its family genomic structure.Slfn5 protein structural domain was determined by NCBI.Results Slfn5 full-length gene sequence was cloned into the expression vector pMSV-GFP,the fragment size was about 2.65 kb by enzyme digestion identification.The conservatism of AAA_4 protein domain in Slfn5 protein family was determined by phylogeny.fr.Conclusion Mouse full-length gene pMSV-Slfn5-GFP expression vector is successfully constructed.

pMSV-Slfn5-GFP； construction； gene structure； analysis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.003

国家自然科学基金资助项目(81560056)。 作者简介：况春燕(1976-)，副主任医师，博士，主要从事冠心病，血管损伤和修复的研究。

Q331

A

1671-8348(2017)22-3033-03

2017-02-22

2017-04-10)