胫神经和腓总神经损伤修复后相应脊髓节段神经元细胞Bcl-2、Bax蛋白表达差异的实验研究

孙光霞, 林耀发, 张 强, 宗海洋,周 军, 谢 铮, 邵弯弯, 林浩东, 侯春林

(上海长征医院, 1. 医疗科; 2骨科, 上海, 200003)

胫神经和腓总神经损伤修复后相应脊髓节段神经元细胞Bcl-2、Bax蛋白表达差异的实验研究

孙光霞1, 林耀发2, 张 强2, 宗海洋2,周 军2, 谢 铮2, 邵弯弯2, 林浩东2, 侯春林2

(上海长征医院, 1. 医疗科; 2骨科, 上海, 200003)

目的 比较大鼠下肢同一平面胫神经、腓总神经损伤修复后相应脊髓节段神经元细胞Bcl-2、Bax蛋白表达差异。方法 雄性SD大鼠90只随机分为3组: A组为对照组, B组为胫神经切断缝合组, C组为腓总神经切断缝合组。分别于术后1、3、7、14、28 d取大鼠L4～6节段脊髓进行HE染色，计算脊髓前角运动神经元数量，采用免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白表达差异，并计算Bcl-2/Bax比值。结果 A组术后脊髓组织未见明显异常, B、C组术后可见脊髓组织结构紊乱，神经元细胞水肿、坏死。术后1、3、7、14 d, B、C组脊髓前角运动神经元数目均小于A组(P< 0.01)。术后3、7、14、28 d, B组脊髓前角运动神经元数目显著多于C组(P< 0.01)。B、C组Bcl-2蛋白表达出下降后上升的趋势，分别于术后3、7 d下降至低谷; B、C组Bax蛋白表达呈现出先上升后下降趋势，均于术后3 d上升至高峰; B、C组Bcl-2/Bax比值呈现出先下降后上升趋势，术后3、7、14、28 d, B组Bcl-2/Bax比值显著高于C组(P< 0.01)。结论 大鼠下肢同一平面胫神经和腓总神经损伤后都会导致近端脊髓神经元细胞出现凋亡，但是和腓总神经损伤相比，胫神经损伤后对近端神经元退变死亡的影响较小。

胫神经; 腓总神经; 神经损伤; 神经修复; Bcl-2; Bax

周围神经损伤再生修复一直是国内外研究的热点。不同部位的周围神经损伤修复后的功能恢复差异较大，如坐骨神经损伤后，胫神经的功能恢复常优于腓总神经[1-4]。造成不同神经再生潜力差异的机制并不明确，可能与相应靶器官、神经结构以及神经元的分布规律有关[5]。研究[6]表明周围神经损伤后远端发生Wallerian变性的同时，近端也会发生逆行性溃变，导致神经元细胞凋亡。神经元的退变、凋亡也会影响神经轴突再生和功能恢复[7]。本研究拟建立大鼠下肢同一平面胫神经和腓总神经切断缝合模型，观察相应脊髓节段神经元细胞的形态、数量，以及Bcl-2、Bax蛋白的表达情况，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年雄性SD大鼠90只，体质量(200±20) g, 由上海西普尔-必凯动物实验有限公司提供。随机分为3组: A组为正常对照组(n=30), B组为切缝胫神经组(n=30), C组为切缝腓总神经组(n=30)。根据术后存活时间分为1、3、7、14、28 d组，每组6只。

1.2 主要试剂、仪器

手术显微镜(上海精密仪器仪表有限公司，中国); 显微外科器械(宁波市成和显微外科器械公司，中国); 光学显微镜(Olympus公司，日本); Bax、Bcl-2免疫组化试剂盒(Dako公司，丹麦)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备: B、C组大鼠以2.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉。俯卧位固定，无菌条件下取右侧股后正中切口，钝性分离肌肉，于大鼠右侧臀肌间隙暴露坐骨神经，顺着外膜组织钝性分离胫神经和腓总神经; B组在距梨状肌下缘0.8 cm处切断胫神经, C组于同一水平切断腓总神经。在手术显微镜下以11-0尼龙缝合线行神经端端吻合，术后给予适量抗生素预防感染。A组仅暴露坐骨神经，不做特殊处理。

1.3.2 取材: 动物存活相应时间后，再次腹腔注射麻醉，仰卧位固定。取胸部正中切口，纵行切开胸骨，暴露胸腔及心脏，小心剪开心包，于心尖处剪1个小口，经左心房插管至主动脉，结扎固定导管位置，再于右心耳处剪开1个小口放血，快速灌注0.01 mol/L PBS 250 mL, 待右心耳流出的液体变清亮后继续缓慢灌注4%的多聚甲醛1 h。待确认大鼠硬化固定后，从腰后正中入路切开皮肤，逐层切除腰后肌肉，暴露大鼠腰椎。仔细咬除椎板后，完整取出L4-6节段的脊髓节段约5 mm, 立即置于液氮中保存。

1.3.3 运动神经元计数: 于液氮灌中取出L4-6节段脊髓组织, OCT包埋、切片，厚约20 μm, 每间隔5张留取1张，裱片, HE染色，梯度乙醇脱水、封固、观察。每只大鼠随机选取3张切片，直接在显微镜下放大200倍进行脊髓前角运动神经元胞体计数，在不同时间点每张切片选取10个高倍视野进行神经元计数。

1.3.4 凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白检测: 采用免疫组化试剂盒进行检测。每只大鼠随机选取5张切片，采用图像分析软件进行半定量分析，以阳性产物的平均光密度度值作为Bax、Bcl-2的表达的定量指标，并计算Bcl-2/Bax比值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行分析。数据以均数±标准差表示。测量所得结果用重复测量的方差分析(ANOVA)进行组间比较。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色

术后不同时间，A组均可观察到大、中型神经元胞体，呈星型，团簇状分布于脊髓前角。胞体体积大于周围胶质细胞，核大而圆，呈嗜碱性深染，核仁明显，胞浆内可见尼氏体。术后1、3、7 d均可见到B、C组脊髓前角组织结构紊乱、水肿，神经元细胞数量明显减少，可见凋亡细胞，胞体明显缩小、变形，胞核致密深染，胞浆深染，呈深红色，细胞周围有较多空晕存在。术后14、28 d脊髓前角组织结构较前逐渐恢复，神经元细胞数量逐渐增多，凋亡细胞数量减少，胶质细胞增生。B组术后14、28 d脊髓组织恢复较C组良好(图1、2)。

图1 B组术后7d脊髓前角HE染色 200倍

图2 C组术后7d脊髓前角HE染色 200倍

2.2 运动神经元计数

B组脊髓前角运动神经元数目在术后1 d出现减少，术后3 d降至最低，随后逐渐开始增多，至术后28 d接近正常; C组脊髓前角运动神经元数目在术后1 d出现减少，术后7 d降至最低，随后逐渐开始增多，术后28 d计数仍小于术后1 d值。

术后1、3、7、14 d, B组脊髓前角运动神经元数目显著少于A组(P<0.01); 术后28 d, 2组比较无显著差异 (P>0.05); C组与A组术后1、3、7、14、28 d比较有显著差异(P<0.01); 术后3、7、14、28 d, B组脊髓前角运动神经元数目显著多于C组(P<0.01), 术后1 d相比无显著差异(P>0.05), 见表1。

表1 脊髓前角运动神经元计数

与A组相比, **P<0.01; 与C组相比, ##P<0.01。

2.3 Bcl-2、Bax蛋白表达变化

Bcl-2、Bax染色定位于胞浆，阳性染色呈棕黄色，细胞核不着色。A组未见明显阳性染色。B、C组Bcl-2蛋白表达呈现先下降、后上升趋势，分别于术后3、14 d下降至低谷; B、C组Bax蛋白表达呈现先上升、后下降趋势，均于术后3 d上升至高峰。术后3、7、14、28 d, B组Bcl-2/Bax值均显著高于C组(P< 0.01), 见表2及图3、4、5、6。

表2 脊髓前角Bcl-2/Bax比值

与C组相比, **P< 0.01。

3 讨 论

作者前期动物实验研究[8]发现，猕猴下肢同一平面胫神经损伤修复后再生速度明显快于腓总神经，胫神经支配的靶肌肉功能恢复也优于腓总神经，证实了不同周围神经损伤后再生潜力存在差异性。

神经细胞作为一个形态和功能的整体，胞体与轴突之间联系十分密切。神经纤维的轴浆运输对神经元的生存以及正常生理功能的维持均起十分重要的作用，因此轴突损伤必然会累及神经元[9]。研究[6]表明，周围神经损伤后其近侧端发生逆行性溃变，神经元也会发生不同程度的变性甚至死亡，目前认为神经元的这种死亡为凋亡。而神经元的退变、死亡也会影响神经轴突的再生和功能恢复[7]。轴突损伤后，除产生上述变性反应外，也会产生再生性改变，在形态上表现为生长锥形成，相应神经元胞体合成代谢增强，如多胺生成酶暂时上调，从而使腐胺、精胺、亚精胺促进轴突生长[10]。因此周围神经损伤后神经元细胞体是否存活以及神经元的功能状态是神经损伤后功能恢复与否的关键性因素之一。只有受损神经元胞体的存活且有再生能力，才能够调控轴突成功再生。如果变性期神经元死亡过多，将无法合成充分的营养物质供轴突修复再生需要。目前研究[11]认为周围神经损伤后神经元胞体死亡与动物年龄、轴突损伤部位、损伤性质以及神经元的类型有关。但不同周围神经损伤后相应的脊髓前角运动神经元退变死亡程度是否存在差异并不明确。

图3 B组术后7dBcl-2蛋白表达 400倍

图4 C组术后7dBcl-2蛋白表达 400倍

图5 B组术后7dBax蛋白表达 400倍

图6 C组术后7dBax蛋白表达 400倍

细胞凋亡进程可以分为诱导期、效应期和降解期。在诱导期，细胞接受各种信号，从而引发各种不同的效应。进入效应期后，经过一些决定细胞存活(死亡)的分子调控点，细胞进入不可逆的程序化死亡。这些调控分子包括一系列原癌基因和抑制癌基因的产生，其中Bcl-2家族起着决定性的作用，降解期则产生可见的凋亡现象。Bcl-2基因是一种原癌基因，通过细胞催化抗氧化作用、抑制钙离子跨膜流动、离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白、与Bax形成异源二聚体、抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的活化等阻断细胞凋亡的早期环节来发挥作用[12]。Bcl-2蛋白是一种与细胞器，尤其是线粒体膜相关的稳定蛋白，主要位于线粒体外膜、内质网膜和核膜，其可保护膜的稳定性，减少细胞内、核内Ca2+浓度的改变，从而阻止凋亡信号的传导。Bcl-2基因的表达及其蛋白增加可抑制细胞凋亡，提高细胞存活能力。Bax基因与Bcl-2基因具有高度的同源序列, Bcl-2和Bax可相互作用为二聚体。Bax基因所编码的膜相关蛋白是一种强有力的细胞死亡促进因子。Bax增高，促进细胞凋亡并抑制Bcl-2的抗凋亡作用[13]。Bcl-2蛋白的活化受Bax的调节, Bax的表达可以增加线粒体的通透性，释放Cytc入细胞质，激活caspase-3, 从而引发细胞凋亡。同时, Bcl-2/Bax的比值在细胞凋亡中起关键作用，比值高，细胞存活率高; 比值低，细胞存活率低。测定Bcl-2/Bax的比值有助于判断是否发生凋亡[14]。因此，本研究也采用Bcl-2/Bax的比值来比较胫神经和腓总神经损伤后近端神经元的凋亡发生情况。

本研究发现，胫神经和腓总神经损伤后，脊髓前角组织均出现结构紊乱、细胞数目减少，并出现细胞凋亡现象。胫神经损伤损伤修复后，脊髓前角运动神经元数目早期出现减少，于术后3 d下降至最低值，随后逐渐增加，至术后28 d时与正常组无显著差异。腓总神经损伤修复后，脊髓前角运动神经元减少呈现较为缓慢的变化，逐渐下降，至术后7 d下降至最低值，随后缓慢增加，至术后28 d仍低于正常组。术后3、7、14、28 d, B组脊髓前角运动神经元数目多于C组。胫神经和腓总神经损伤修复后，脊髓前角Bcl-2和Bax表达出现动态变化过程[15-17]。Bcl-2表达趋势为先下降后上升, Bax表达趋势是先上升后下降。Bcl-2/Bax比值在胫神经和腓总神经损伤修复组均呈现出先下降后上升的趋势，在胫神经损伤修复组术后3 d下降至最低，在腓总神经损伤修复组术后7 d下降至最低。术后3、7、14、28 d, B组Bcl-2/Bax值均高于C组。结合脊髓前角运动神经元计数和Bcl-2/Bax比值，可发现胫神经损伤后对近端神经元退变死亡的影响较小，这可能是同一平面的胫神经和腓总神经损伤修复后胫神经功能恢复相对较好的原因[18-19]。

综上所述，大鼠下肢同一平面的胫神经和腓总神经损伤后都会导致近端脊髓神经细胞出现凋亡，但是胫神经损伤后导致的神经细胞凋亡数较少，即胫神经损伤后对近端神经元退变死亡的影响较小，这可能是不同周围神经损伤后再生潜力存在差异的机制之一。

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Expression of Bcl-2 and Bax proteins in the neurons of spinal cord segment after tibial nerve and common peroneal nerve injuries in rats

SUN Guangxia1, LIN Yaofa2, ZHANG Qiang2, ZONG Haiyang2, ZHOU Jun2, XIE Zheng2, SHAO Wanwan2, LIN Haodong2, HOU Chunlin2

(1. Medical Department; 2. Department of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai, 20003)

Objective To explore the expressions of Bcl-2 and Bax proteins in the neurons of spinal cord after tibial nerve and common peroneal nerve injuries in rats. Methods A total of 90 male SD rats were randomly divided into three groups, the group A was as control group, group B as suture of tibial nerve cut group, and group C as suture of the common peroneal nerve cut group. The L4-6segment spinal cord of the rats were removed for HE staining and immumohistochemical staining on 3, 7, 14, 28 days after the operation. The number of motor neurons in the spinal anterior horn were calculated. The expressions differences of Bcl-2 and Bax proteins were detected by immuno-histochemistry, and values of Bcl-2/Bax were calculated. Results The number of motor neurons in the anterior horn of spinal cord in group B were less than that in group C on 1, 3, 7, 14, 28 days after the operation (P< 0.01). The expression of Bcl-2 protein in group B and group C showed an upward and then declining trend. It decreased to the lowest on the postoperative 3 d in group B and 7 d in group C, respectively. The expressions of Bax protein in group B and C showed an upward and then declining trend, and it increased to the highest on the postoperative 3 d in groups B and C. The values of Bcl-2/Bax in groups B and C were showed an decreased and then increased trend and it was lower in group B than group C on the postoperative 3, 7, 14, 28 d(P< 0.01). Conclusion Injuries of tibial nerve and common peroneal nerve of the rats would lead the apoptosis of motor neurons in the spinal cord, but compared with the injury of common peroneal nerve, tibial nerve injury would lead less apoptosis of motor neurons.

tibial nerve; common peroneal nerve; nerve injury; nerve repairmen; Bcl-2; Bax

2017-03-20

国家自然科学基金(81572146)

林浩东

R 741

A

1672-2353(2017)15-005-05

10.7619/jcmp.201715002