microRNA在结直肠癌诊断、治疗及预后中的研究进展*

胡秀秀，孙慧玲，潘玉琴

(南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院中心实验室，南京 210012)

·综述·

microRNA在结直肠癌诊断、治疗及预后中的研究进展*

胡秀秀，孙慧玲，潘玉琴

(南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院中心实验室，南京 210012)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)由于其高患病率和死亡率成为世界性的公共卫生问题。研究发现，微小RNA(microRNA，miRNA)在CRC发生、发展中起着重要的作用，与CRC的诊断、分期、进展和预后密切相关，为CRC的早期发现和治疗起到一定的指导作用。该文就miRNA的产生及功能、检测技术及其在CRC中的临床应用价值作一综述。

微小RNA；结直肠癌；诊断；治疗；预后

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是发生于结肠或直肠中的最常见的消化道肿瘤之一。随着对CRC发病机制的深入研究，微小RNA(microRNA，miRNA)引起了人们的广泛关注。根据microRNA癌症协会数据库(microRNA Cancer Association Database)[1-3]提供的数据，至2017年3月，仅PubMed数据库可检索的研究人CRC中miRNA的文献近400多篇，关注的miRNA有160多种，涉及发病机制及应用等方面。

miRNA是由约22个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物细胞中，它通过与其靶mRNA分子的3′端非编码区域(3-untranslated region，3′UTR)完全或不完全碱基配对，诱导mRNA的降解或抑制其蛋白质的表达，从而在转录后水平对基因表达进行调控。1993年Lee等[4]在线虫(Caenorhabditis elegans)幼虫中发现第1个miRNA(lin-4)，随即展开了对miRNA的广泛研究。miRNA具有癌基因或抑癌基因的功能，其异常表达可能引起多个靶基因的改变，从而对细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等肿瘤生物学过程产生影响。

1 miRNA的产生与功能

miRNA在生物体内由miRNA基因编码，miRNA基因分布于各染色体上，可位于基因间、内含子或外显子上，且多个miRNA基因常成簇存在。在细胞核内，基因组DNA转录生成含有至少1个发夹样结构的miRNA的初始转录物(pri-miRNA)，pri-miRNA为长RNA转录本，在细胞核内被核糖核酸酶Drosha加工成具有发夹结构的miRNA前体，然后通过核输出蛋白exportin5转运出细胞核，在细胞质中被核糖核酸酶Dicer切割掉末端的环状区域，形成双链RNA片段，后者随即被组合至RISC复合体中并对2条链进行选择，选出其中1条形成有活性的RISC复合体，发挥其多样性的调控功能[5]。约有60%的miRNAs为独立表达，15%的miRNAs成簇表达，另有25%的miRNAs位于内含子。

2 miRNA在CRC中的检测技术研究进展

miRNA由于片段短小，家族成员之间序列高度同源，检测相对困难。近年来，学者们针对miRNA的检测方法进行了深入的研究，创建出了许多敏感性高、特异性强、高通量的方法，其中基于探针杂交或样本扩增是应用最广泛的方法。

2.1 miRNA检测的常规方法 miRNA检测的经典方法包括Northern印迹杂交(Northern blot)、微阵列芯片(Microarray)、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)以及测序法，其中Northern blot最早用于miRNA的检测，是最经典方法，其主要原理是将标记的与目标miRNA互补的DNA探针杂交到硝酸纤维素膜上，然后显影检测，但因其检测过程繁琐、敏感性低，费时等缺点从而限制了其临床诊断应用。微阵列芯片是一种能同时对多个miRNA进行分析检测的高通量研究技术，该技术主要是将芯片上的多个已知序列的探针与miRNA杂交，然后根据杂交后检测到的信号强度及数据分析，从而构建特异性miRNA表达谱。该技术在miRNA表达差异谱分析中应用较广，但同样存在敏感性低、操作难、重复性差等缺点。qRT-PCR是miRNA检测最为常用的技术，该方法是在PCR反应体系中加入特殊的荧光基团，通过荧光信号来实时定量观察PCR的全进程，具有较高的敏感性及特异性，但是由于成熟miRNA长度较短，该方法通常需要对miRNA进行加尾后逆转录或者用带有茎环结构的引物来对miRNA进行逆转录，不稳定性大大增加，另外，精确的温度控制、精细的探针及引物设计以及较高的成本是该类方法无法回避的不足之处。以上方法均是建立在miRNA序列已知基础上，而近年来新发现的下一代测序、克隆测序等方法可用于miRNA种类及特定miRNA的表达分析。

2.2 基于信号放大技术的miRNA的检测新方法 基于信号放大的检测方法因其突出的检测敏感性已成为miRNA检测中十分重要的技术。目前研究相对成熟的有滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)、荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH) 结合RCA、基于特异性酶辅助检测以及纳米孔检测等技术。这些方法大多结合了靶标在反应过程中的循环利用以及信号多重放大效应来提高敏感性[6-7]。RCA是一种恒温扩增核酸方法，设计的引物与环状模板链连接后，在聚合酶作用下复制出无数个重复的环的互补序列，可在短时间内使miRNA分子数量倍增，使检测信号放大。FISH结合RCA的方法在短时间内实现细胞内miRNA的定位以及定量分析，对研究细胞内miRNA的功能及相关疾病发生的分子机制有重要意义。核酸酶因作用明显、可明显增强荧光信号等优点，在miRNA检测领域中，目前逐渐得到应用。Duan等[8]设计了一种基于核酸外切酶和切口酶的等温扩增体系检测细胞提取物中的miRNA，该方法信号放大机制不仅由靶miRNA本身所触发，还包括反应过程中循环产生的寡核苷酸单链，大幅度提高检测的敏感性。近些年来，纳米材料因其相对表面积大、有特殊的光学、磁学和导电性能等特点成为miRNA检测方法的研究焦点，Wanunu等[9]在氮化硅膜上制作出直径为3 nm的纳米孔，miRNA与探针杂交并通过与病毒蛋白P19结合来富集杂交形成的复合体，当复合体分子通过纳米孔时，会产生一个良好的信号，从而检测探针-miRNA复合体的丰度。单种或多种纳米材料的应用使体液中极低含量miRNA的检测成为可能。

3 miRNA对CRC发生、发展的调控作用

随着研究的深入，影响CRC细胞增殖、侵袭和转移的miRNA也越来越多的被发现。miRNA具有抑癌基因或者癌基因的功能,主要通过调控CRC发生、发展相关通路的一些蛋白质影响CRC的增殖、侵袭和转移等，包括Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catein)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase,PI3K/AKT)、转化生长因子β(TGF-β)等信号通路的相关蛋白质，以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等[10]。如当Wnt通路激活时，细胞核外Wnt家族分泌性相关蛋白(Wnt)通过一系列生物学过程引起细胞质内β-catein降解障碍，胞质中游离β-catein积累并进入细胞核，与核内转录因子结合，启动下游基因转录。在CRC发病机制中，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活使β-catenin在细胞核内明显增加，引发相应细胞过度增殖和恶变，最终导致CRC的发生。目前研究显示，miR-490-3p具有抑癌的作用，其表达上调，抑制了重排蛋白1(frequently rearranged inadvanced T-cell lymophomas 1,FRAT1)的表达，阻断Wnt/β-catenin通路中β-catenin进入细胞核，从而抑制CRC的发生[11]。miR-224能够靶向调节糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)和分泌型卷曲相关蛋白2(Secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因，激活Wnt/β-catenin信号通路，引起β-catenin移入核内[12]。下调miR-224，恢复GSK3β和SFRP2的表达水平，能够削弱Wnt/β-catenin通路介导的CRC细胞增殖和转移。miR-155在CRC中能够通过抑制HMG盒转录因子1(HMG-box transcription factor 1, HBP1)亦能增强Wnt/β-catenin 信号通路[13]。

越来越多的证据显示在CRC中观察到的一些miRNA与肿瘤的转移有关。miRNA调节肿瘤细胞侵袭转移的机制主要包括:(1)调节肿瘤细胞上皮-间质转化(epithelial -mesenchymal transitions,EMT),miR-194通过下调E-钙粘蛋白(E-cadherin,CDH1)与上调波形蛋白(vimentin)和MMP-2的表达来调控EMT,进而影响CRC细胞的转移[14]。(2)调控癌基因、抑癌基因表达,Wang等[15]发现miR-219-5p在CRC患者中异常表达，其通过靶向下调钙磷蛋白(calcyphosphine，CAPS)发挥抑癌基因的作用。CAPS作为一种钙结合蛋白，其合成和磷酸化受cAMP的调节，参与了cAMP及钙-磷脂酰肌醇级联介导的交叉信号传递途径，而cAMP和IP3/Ca2+则是控制细胞生长和分化最为重要的途径，推测CAPS作为一种肿瘤特异性蛋白质，可能在调控细胞的生长和分化方面起重要的作用。上调miR-219-5p可以抑制CAPS进而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。miRNA还可通过调控肿瘤细胞生长的微环境、调节肿瘤转移相关基因表达及血管生成等途径调节肿瘤细胞的转移[16]。

4 miRNA在CRC中的应用研究

随着对肿瘤中miRNA角色的深入挖掘，其在肿瘤诊断、治疗及预后等方面的价值也被不断的发现与评估。

4.1 miRNA在CRC诊断中的作用 CRC的转归和预后与肿瘤的分期密切相关, 早期CRC患者多数可获得良好的预后,而发生远处转移的晚期患者的5年生存率仅为12%。由于CRC早期症状不明显，大部分患者确诊时已处于癌症晚期，因此开展对CRC的早期筛查，以期早发现、早治疗，对提高患者的生存率及生活质量具有重要的临床价值。目前许多检查如肿瘤标志物、肠镜以及一些其他的影像学方法，因敏感性、特异性不高、价格昂贵、有创性等原因，导致CRC早期筛查和诊断仍相对困难。

miRNA表达水平在不同疾病之间、在CRC的癌前病变阶段存在差异性，这为CRC早期筛查和诊断提供了新的思路。Ramzy等[17]对结肠癌、结肠腺瘤性息肉、炎症性肠病、正常结肠组织的标本进行比较，发现miR-145在癌组织中明显下调。此外，CRC患者癌组织中亦存在其他miRNA的特异性差异表达，但若通过提取组织中的miRNA来诊断预测，创伤性大，且成本较高。miRNA可以被分泌到细胞外，成为细胞微环境和机体体液中重要的调控分子，在人体乳汁、唾液、尿液、外周血中均存在miRNA。检测外周血、粪便等易获取标本中的miRNA无疑是CRC早期筛查更好的选择。Imaoka等[18]用CRC、结直肠腺瘤患者及健康人血清各3例进行miRNA微阵列分析，并对CRC细胞系及血清进一步筛选，发现miR-1290在CRC及腺瘤患者血清中的含量较健康人明显升高，扩大血清样本量检测，发现血清miR-1290的表达水平能够将健康人与腺瘤(AUCROC=0.718，敏感性46.4%，特异性91.2%)和CRC患者(AUCROC=0.830，敏感性70.1%，特异性91.2%)区分开，表明miR-1290或许可以用于CRC的诊断。许安东等[19]研究miRNA(miR-150,miR-424,miR-29b,miR-96)在CRC组织和粪便中的表达情况，其纳入了77例CRC患者以及43名健康志愿者，发现miR-424在健康组中的表达量明显低于肿瘤组(P<0.05),miR-424的曲线下面积(AUCROC)为0．75，而miR-424对CRC的诊断具有69.94%的敏感性和74.42%的特异性。Wu等[20]发现粪便中的miR-135b在CRC和晚期腺瘤中较健康人相对高表达(P<0.01)，但术后其表达量明显下降(P<0.01)，表明miR-135b可作为一种检测CRC和晚期腺瘤的生物学标志物，并能反应手术效果。被分泌到细胞外及外周血的miRNA 稳定性好，不易降解，并且具备生物学活性。尽管当前临床miRNA早期诊断标志物仍未进入临床应用阶段，但以上研究结果提示，深入挖掘血液、粪便等差异表达miRNA，探寻其分子机制，将可能获取高特异性、高敏感性、易于推广的无创CRC筛查方法。

4.2 miRNA在CRC治疗中的作用 miRNA直接或间接调控蛋白质，其功能的获得或缺失，在很多情况下与各种疾病的发生、发展有着密切的关系。在一些miRNA表达异常的癌症中，miRNA成为很有希望的治疗药物(miRNA类似物形式)或治疗靶点(Anti-miRs形式)。一些miRNA靶向治疗CRC已进入临床研究阶段，比如miR-34a、miR-143、miR-145等目前均有众多学者进行研究[21]。但当前也面临着许多的挑战，包括增加对体内应用的miRNA类似物及Anti-miRs的稳定性，提高miRNA传送系统的特异性和有效性,降低毒性反应等。1个miRNA分子可以调控数百个蛋白质的表达，考虑到miRNA分子调控机制的复杂程度，现在还不能精确地只对1个miRNA分子施加影响而不会“伤及”其他成员。

已有众多学者将目光放在了miRNA辅助治疗的价值上面,发现miRNA是调节放化疗敏感性的重要生物学分子。除了手术治疗外，放化疗也是CRC的常用治疗手段，特别是在疾病的晚期。但在许多情况下，最初对化疗有反应的患者到后期会产生耐药，增加了治疗的困难。研究表明，miR-330在CRC组织中低表达，具有抑癌基因的作用[22]。miR-330 靶向调节TYMS的表达，抑制细胞增殖并且提高CRC细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性，表明miRNA可以作为CRC治疗的潜在分子靶点。Zhou等[23]检测了74例CRC组织中miR-506水平，发现奥沙利铂耐药组miR-506低表达，而通过细胞实验进一步发现，上调miR-506可以通过Wnt/β-catenin 通路抑制多药耐药基因(MDR1)及其糖蛋白(Pgp) (MDR1/P-gp )的表达进而提高CRC细胞对奥沙利铂的敏感性，表明miR-506可降低CRC患者对奥沙利铂的耐药性。Zheng等[24]对miR-195进行研究，发现其可以通过抑制CARM1增加CRC细胞对放射治疗的敏感性。以上研究均表明miRNA具有提高CRC细胞药物敏感性，降低药物抵抗性的临床应用价值。

4.3 miRNA在CRC预后中的作用 尽管外科手术治疗技术已获得长足进步，但CRC患者术后仍有较高的复发风险，而且不同患者对临床辅助疗法的反应也不尽相同。临床上对预后的评估主要依赖于患者临床表现、病理学及传统肿瘤标志物检查，但肿瘤转移或复发时常无明显临床症状，而病理学证据重复性差，难获取，传统的肿瘤标志物敏感性较低。一些研究发现CRC细胞的miRNA表达谱与预后密切相关。如Maierthaler等[25]发现血浆miR-122的高表达与CRC预后相关。非转移性CRC患者无复发生存率(HR:1.370,95%CI:1.028～1.825)和总生存期(HR:1.353,95%CI: 1.002～1.828)以及转移性CRC无复发生存率(HR:1.264, 95%CI: 1.050～1.520)和总生存期(HR:1.292, 95%CI: 1.078～1.548)均表明miR-122高表达者预后差，提示血浆中的miR-122可以作为CRC预后的标志物。Tsukamoto等[26]发现CRC的miRNA表达与其不同分期有关。其对同一患者获得的血浆、原发性瘤组织及肝转移组织进行miRNA微阵列分析筛选，并经326例CRC患者血浆标本确认有差异的miRNA，结果发现miR-21在血浆、原发肿瘤组织和肝转移组织中均高表达，血浆中miR-21水平与肝转移及TNM分期相关，且高表达miR-21的患者总生存期(OS)和无病生存期(DFS)明显低于miR-21低表达的患者，表明对于Ⅱ～Ⅳ期直肠癌患者，miR-21是独立的预后因素，可预测不同分期患者的预后。

笔者对microRNA癌症协会数据库(microRNA Cancer Association Database)[1-3]提供的从建库至2017年3月，仅PubMed数据库可检索的人CRC中的miRNA的数据进行整理，并对PubMed数据库2017年3月至2017年5月报道的人CRC中的miRNA进行检索，与诊断、治疗、转移及预后相关的已研究的miRNA见表1。

表1 pubmed可检索的人CRC中相关miRNA

注：因microRNA癌症协会数据库提供的仅是PubMed数据库可检索的文献，其他数据库中报道的CRC相关miRNA并未检索，故“/”表示还有未列举的miRNA。

5 miRNA的研究展望

随着对miRNA作用机理的深入研究，以及利用miRNA微阵列芯片、高通量测序等技术手段，我们对miRNA和CRC之间的关系，认识越来越清晰，对高等真核生物基因表达调控网络理解的水平也越来越高。这可能使miRNA成为疾病诊断、监测的新的潜在生物学标志物，还可能使其成为分子治疗靶标，或是模拟该分子进行新药研发，为CRC的治疗提供一种新的有效手段。不过，目前依然存在很多阻碍miRNA研究走向临床的问题。目前能够真正用于临床的miRNA生物学标志物很少。且绝大多数研究仅关注于miRNA调控靶基因的功能，而其自身又受哪些因素调控，还有多少miRNA没有发现？仍需要进一步研究证实。此外，利用miRNA分子治疗CRC，输送途经的安全问题、疗效问题等均需要进一步解决，才能使miRNA真正造福患者。

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.18

国家自然基金青年基金项目(81501820)。

胡秀秀，1991年生，女，硕士研究生，研究方向为肿瘤分子生物学诊断。

潘玉琴，主管技师，硕士,E-mail：panyuqin01@163.com。

R735.3

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2017-04-19)