肾病综合征患儿肾活检组织miRNA检测及意义*

骆峻，路美玲，王成，夏正坤，张春妮

(1．江苏卫生健康职业学院中心实验室，南京 210029; 2.南京总医院a.检验科，b. 小儿科，南京 210002)

·临床实验研究·

肾病综合征患儿肾活检组织miRNA检测及意义*

骆峻1，路美玲2a，王成2a，夏正坤2b，张春妮2a

(1．江苏卫生健康职业学院中心实验室，南京 210029; 2.南京总医院a.检验科，b. 小儿科，南京 210002)

目的 分析肾病综合征患儿肾活检组织miRNA的表达水平，并探讨其作为区分肾病病理亚型潜在标志物的可能性。方法 收集肾病综合征患儿肾组织活检标本41例，包括系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)22例、微小病变(MCD)8例和毛细血管内增生性肾小球肾炎(ECPGN)11例，以8例无肾功能不全的成人肾组织为对照组。RT-qPCR检测各组肾组织中miR-191、miR-151-3p、miR-150、miR-19b和miR-30a-5p的表达水平，并分析其与肾功能相关临床指标的相关性。结果 与正常肾组织相比，肾病综合征患儿肾组织中miR-191明显上调(P<0.01)，miR-151-3p明显下调(P<0.01)。此外，MCD组miR-150表达水平明显低于对照组、MsPGN组和ECPGN组(P均<0. 05)。 miRNA在肾组织中的表达与临床血清学指标IgG、TP和Cr均呈正相关，与TC呈负相关(P均<0.05)。结论 miRNA在肾病综合征患儿肾组织中的表达与病理分型有关，miR-150具有潜在区分肾病患儿MCD型与其他亚型的鉴别诊断价值。

微小核糖核酸；肾活检；肾病综合症；儿童

肾活检是确定肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)病理类型的金标准，对指导临床治疗具有至关重要的作用[1]。研究表明，miRNA与多种临床疾病相关[2]，其中，在肾脏发育、新陈代谢和肾功能障碍、损伤过程中起重要作用[3]。另有研究表明，肾小球损伤的成人肾组织中一些特定miRNA表达失调[4]，而在肾病患儿肾组织中的表达水平的相关研究极少。本课题组前期研究[5]发现，肾病综合征患儿血清miRNA的表达水平与健康人对照组差异有统计学意义，其中miR-191、miR-151-3p、miR-150、miR-30a-5p和miR-19b的表达水平均明显升高。本研究通过检测该5种miRNA在肾病综合征患儿肾组织中的表达水平，以期进一步分析其临床意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象及标本采集 收集2013年1-6月在南京总医院小儿科就诊的肾病综合征患儿肾活检组织样本41例，男23例、女18例，年龄(8.3±2.9)岁。根据1995年WHO修订的第二版标准文件对肾小球疾病进行病理分型[6]，其中系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, MsPGN)22例、微小病变(minimal change disease, MCD)8例和毛细血管内增生性肾小球肾炎(endocapillaryproliferative glomerulonephritis, ECPGN)11例。纳入标准：(1)临床明确诊断为各类型原发性肾小球肾炎肾病综合征患儿;(2)年龄不超过14周岁;(3)肾活检病理分型属于本研究涉及的3种病理类型。与急性感染性肾炎、代谢性肾疾病、肾细胞癌等进行鉴别诊断，并予以排除。患儿行肾活检前均经过一定疗程临床药物治疗。收集同期就诊的8例无肾功能不全的成人肾组织(从用于诊断目的肾活检剩余或肾切除术中获得)作为对照组，男5例、女3例，年龄(53.9±13.6)岁，均经病理诊断无肾脏组织细胞病变。所有受试者的组织样本获取后立即用液氮冷冻，使用前置-80 ℃保存。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者父母知情同意。

1.2 仪器与试剂 7500型qRT-PCR仪、2720型PCR仪(美国ABI公司)；7600型全自动生化分析仪(日本日立公司)；CP全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂(德国西门子公司)；1612-1型高速离心机(上海医疗器械公司)；5418型高速冷冻离心机、分光光度计(德国Eppendorf公司)；SAS67120型超纯水机(美国Millipore公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；氯仿、异丙醇及无水乙醇(上海化学试剂公司)；DEPC处理的ddH2O(南京凯基公司)；逆转录反应试剂、qRT-PCR反应体系(大连TaKaRa公司)；TaqMan探针试剂(美国ABI公司);生化试剂盒(英国Randox公司)。

1.3 肾功能相关临床指标的测定 按照全自动生化分析仪及相应的生化试剂盒说明书操作测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、总蛋白(TP)、清蛋白(Alb)、肌酐(Cr)、尿素(Ure)和尿酸(UA)的含量。尿微量清蛋白(uAlb)采用免疫比浊法测定。比浊法测定免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)及免疫球蛋白E(IgE)的浓度。补体C3、C4用全自动化学发光免疫分析仪测定。以上检测参数均由仪器直接输出检测结果。

1.4 RNA提取及miRNA的测定

1.4.1 组织RNA提取 取组织样本研磨，每100 mg组织样本中加入1 mL Trizol试剂，用氯仿震荡混匀，冰上静置10 min，4 ℃、16 000×g离心20 min，收集上清液；加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃静置1～2 h，4 ℃、12 000×g离心20 min；留沉淀，加入1 mL 75%DEPC-乙醇，涡漩混匀，4 ℃、12 000×g离心20 min。留沉淀，待干燥后加20 μL DEPC处理的ddH2O至RNA完全溶解，测定RNA浓度及纯度(A260/280 nm),取吸光度1.8～2.0的样本用于后续实验。将RNA浓度调至0.5 μg/μL，置-80 ℃保存。

1.4.2 引物设计及逆转录反应 针对每种miRNA，由美国ABI公司设计并合成1个具有相同茎环结构的基因特异性反向引物[7]。按照逆转录试剂盒说明书操作将DNA逆转录为cDNA，cDNA样本置-20 ℃保存。

1.4.3 RT-qPCR反应 采用基于TaqMan探针的qRT-PCR方法检测miR-30a-5p，RT-qPCR反应体系试剂盒由TaKaRa公司提供，TaqMan探针由美国ABI公司提供，仪器使用ABI 7500 PCR仪，实验方法参照参考文献[7]。PCR循环参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。以U6作为内参照。肾病综合征患儿标本相对于对照组标本中miRNA的变化倍数用2-ΔCt法计算。试验重复3次。

2 结果

2.1 各组患儿肾功能临床参数比较 3种病理亚型的肾病综合征患儿血清IgG、IgA、C3、C4、TC、TP、Alb、UA和uAlb浓度组间差异有统计学意义(P均<0.05)，而在年龄、血清中IgM、IgE、TG、Ure和Cr浓度差异无统计学意义。见表1。

2.2 不同病理亚型肾病综合征患儿肾组织中miRNA表达水平比较 与对照组相比，3组肾病亚型中miR-191均明显上调(P<0.05)，而miR-151-3P均明显下调(P<0.01)。MCD组患儿miR-150表达水平明显低于对照组、MsPGN组和ECPGN组(P均<0.05)。MsPGN组患儿miR-19b表达水平明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表1 不同病理亚型肾病综合征患儿临床肾功能指标比较

注：与MsPGN组比较，*，P<0.05；与MCD组比较，#，P<0.05。

表2 不同病理亚型肾病综合征患儿肾组织miRNA表达水平(2-ΔCt值)

注： 与对照组比较，#，P<0.05；与MsPGN组比较，△，P<0.05；与MCD组比较，◇，P<0.05。

2.3 miRNA与肾病综合征患儿临床肾功能指标的相关性分析 miR-191表达水平与IgG和TP呈正相关(P均<0.05)；miR-151-3p表达水平与TP呈正相关(P<0.05)；miR-150表达水平与IgG、TP和Cr呈正相关(P<0.05)，与TC呈负相关(P<0.05)；miR-30a-5p表达水平与TP呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 肾病综合征患儿肾组织中miRNA表达与临床参数的相关性

3 讨论

王燕等[8]研究发现肾病综合征患儿血清中miR-151-3p表达水平升高，而经临床治疗好转后表达水平下降，与本研究结果较为一致，提示miR-151-3p可能与肾病综合征患儿临床表征或肾小球损伤程度有关。miR-191是N-脱乙酰基酶/ N -磺基转移酶1(NDST1)的作用靶点，该酶在肾组织中存在特异性表达，而NDST1基因敲除小鼠肾基底膜发生结构和功能异常[9]，提示miR-191在维持基底膜正常生理功能方面具有潜在的研究价值。本研究发现miR-19b在MsPGN组表达上调，而胡佳等[10]研究提示肾癌的发生可能与miR-19b-1上调有关。Wu等[11]发现miR-30a-5p和miR-30家族其他成员在肾病患者足细胞中下调，促进足细胞损伤，并进一步证实miR-30通过靶向作用于Notch1和p53来保护足细胞，但本研究中miR-30a-5p表达水平未见明显异常。

本研究还发现miR-150在MCD患者的肾内表达水平明显低于对照组和其他肾病亚型；Zhou等[12]发现miR-150过表达可以促进肾间质纤维化，表明miR-150可能作为一种潜在的生物学标志物定量狼疮性肾炎肾损伤。此外，miR-151-3p和miR-150可调节降钙素受体(CALCR)和叉头蛋白P1(FOXP1)，该两者参与免疫系统的发育过程[13]。一般来说，肾脏疾病往往始于肾小球损伤，导致肾小管间质损伤，后者通常表现为肾小球系膜细胞、内皮细胞和足细胞的损伤，最终导致肾功能异常[14]。MCD是肾病患儿综合征最常见的形式，但在病变未出现肾小球硬化和间质纤维化时，往往不能与其他类型的肾小球疾病区分[15]。本研究结果提示肾组织miR-150表达水平可能是一个潜在的区分MCD和其他肾病亚型的指标。

此外，本研究还通过Spearman相关系数分析发现miRNA与部分临床常用血清学指标明显相关，尤其是肾内miR-150水平与IgG、TC、TP、Cr相关性显著，提示miR-150与临床肾功能血清学指标联合检测可能会更好的对肾病儿童MCD亚型进行临床鉴别诊断。此外，值得注意的是血清TP指标与miR-150、miR-191、miR-151-3p、miR-30a-5p均呈现良好的正相关性，其机制尚待进一步探讨。

本研究存在一些不足之处，如各组患者样本量较少，因无法获得正常儿童肾组织对照而只能采用成人肾组织作为对照组，未考虑不同种族间miRNA表达的差异性[16]等因素。因此，尚没有足够的统计学证据以得出确证的结论。但量化肾病综合征患儿肾组织中miRNA的表达水平是一项新颖而有意义的研究。总之，本研究发现肾病患儿患者肾组织中miR-191、miR-151-3p、miR-150及miR-19b表达失调。这些miRNA在肾组织中异常表达可能与肾病患儿发病机制有关。miR-150具有潜在的区分MCD与其他亚型的鉴别诊断价值。

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(本文编辑：许晓蒙)

Detection of miRNA in kidney biopsies of child patients with nephrotic syndrome and its significance

LUOJun1,LUMei-ling2a,WANGCheng2a,XIAZheng-kun2b,ZHANGChun-ni2a

(1.CentralLaboratoryofJiangsuHealthVocationalCollege,Nanjing210029,Jiangsu; 2a.DepartmentofClinicalLaboratory, 2b.DepartmentofPediatry,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China)

Objective To investigate the expression levels of miRNA in kidney biopsies of child patients with nephrotic syndrome and the possibility of miRNA as potential markers in differentiating the pathologic subtypes of nephrosis. Methods Kidney biopsy specimens from 41 child patients with nephrotic syndrome, including 22 with mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN), 8 with minimal change disease (MCD) and 11 with endocapillary proliferative glomerulonephritis (ECPGN), were collected, and adult nephridial tissues from 8 patients without renal inadequacy were selected as controls. The expression levels of miR-191, miR-151-3p, miR-150, miR-30a-5p and miR-19b in nephridial tissues were detected by RT-qPCR, and their correlations with renal function related parameters were analyzed. Results Compared with the controls, the miR-191 levels in kidney tissues of child patients with nephrotic syndrome increased significantly (P<0.01), while the miR-151-3p levels decreased obviously (P<0.01). The expression levels of miR-150 in MCD patients were significantly lower than those in MsPGN and ECPGN patients and the controls (P<0.05). The expression levels of these miRNAs were positively correlated with serum IgG, TP and Cr levels, but negatively with serum TC levels (P<0.05). Conclusion The expression levels of miRNA in kidney tissues of child patients with nephrotic syndrome are related to pathological typing of nephrosis, and miR-150 may be a potential marker which may differentiate MCD from other subtypes of nephrosis.

microRNA; kidney biopsy; nephrotic syndrome; children

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.10

国家自然科学基金(81472021);南京总医院基金(2012041)。

骆峻，1974年生，男，副主任技师，高级实验师，硕士，主要从事医学检验教研工作。

张春妮，主任技师，博士，E-mail：zchunni27@hotmail.com。

R692

A

2017-06-07)