基于16S rDNA测序技术分析不同龄期蚕沙中菌群多样性

郑天瑶 宿树兰 蔡红蝶

[摘要]該文对不同龄期烘干前后蚕沙中菌群多样性进行分析与评价，以期明确其菌群组成及其丰富度差异，阐明烘干处理对中药材蚕沙中菌群的影响，为其功效科学内涵的揭示提供依据和参考。应用高通量测序技术测定蚕沙细菌的16S rDNAV4 变异区序列，应用Qiime，Mothur，PICRUSt等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元（OTUs）数量，分析蚕沙样品中菌群的组成、丰度、分布、Alpha多样性、Beta多样性，菌群差异性及对群落的代谢功能等进行预测。该研究获得用于分析的有效序列数为259 250；稀疏曲线表明测序深度充分，OTU 的数量接近于饱和。蚕沙菌群主要由变形菌门（Proteobacteria，893%）、放线菌门（Actinobacteria，50%）、厚壁菌门（Firmicutes，44%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，11%）、蓝细菌（Cyanobacteria，02%）组成，其优势菌门为变形菌门。烘干后蚕沙的菌群多样性及丰富度降低，五龄蚕沙尤为明显。PICRUSt分析蚕沙菌群对应的基因功能发现膜转运、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、核苷酸代谢，细胞过程与信号传导等基因功能丰度较高。烘干处理可显著降低蚕沙中致病菌的种类和数目，有利于药材药用品质，相比于低龄期蚕沙，五龄蚕沙更适宜入药。Illumina MiSeq 高通量测序技术为蚕沙菌群的研究提供了更加准确、科学的数据资源。

[关键词]不同龄期； 蚕沙； 菌群多样性； 16S rDNA高通量测序

Silkworm excrement bacterial communities diversity in different instars

based on 16S rDNA sequence analysis

ZHENG Tianyao1，2， SU Shulan2*， CAI Hongdie2， DAI Xinxin2， OUYANG Zhen1， DUAN Jinao2*

（1 Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China；

2 Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization， National and

Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae

Innovative Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

[Abstract]This paper investigated the diversity of the silkworm excrement bacterial communities in different ages before and after drying， aiming to clarify the differences of bacterial communities in composition and bacterial abundance and the influences of drying treatment， and provide scientific basis for the efficacy of scientific connotation and utilization of silkworm excrement Highthroughput sequencing technique was used to measure the sequence of 16S rDNAV4 variable region of bacteria in silkworm excrement QIIME， Mothur and PICRUSt software programs were employed to sort and calculate the number of sequences and operational taxonomic units （OTUs） for each sample Thereafter， the abundance， distribution， alpha diversity index of species， beta diversity and bacterial communities diversity among different sample groups and predicted the bacterial gene functions were analyzed In this study， the numbers of effective sequences for six samples were 259 250； the rarefaction curves showed a sufficient sequencing depth， and the number of OTUs was close to saturation The bacteria in silkworm excrement belonged to the following five phylums： Proteobacteria （893%）， Actinobacteria （50%）， Firmicutes （44%）， Bacteroidetes （11%） and Cyanobacteria （02%） The dominant specie was Cyanobacteria of the total bacteria identified， respectively The abundances and diversities of the silkworm excrement bacterial communities have been reduced after drying treatment， especially the silkworm excrement of the fifth instar PICRUSt analysis was performed to show that abundance of the functional genes such as membrane transport， carbohydrate metabolism， amino acid metabolism， lipid metabolism， nucleotide metabolism， cellular processes and signaling were relatively high The result showed that the drying treatment could decreased the species and numbers of pathogenic bacteria in silkworm excrement obviously and improve the quality of medicinal materials Compared with the lower ages， silkworm excrement of fifth instar seems like to be more suitable for use in medicine Illumina MiSeq highthroughput sequencing system provides a more accurate and scientific data resource for the study of bacteria in silkworm excrementendprint

[Key words]different instars； silkworm excrement； bacterial communities diversity； 16SrDNA highthroughput sequencing

蚕沙，即蚕粪，为蚕蛾科昆虫家蚕Ombyx mori L幼虫的干燥粪便，是我国的传统中药，在《名医别录》和《本草纲目》均有记载，具有祛风除湿、清热明目、活血定痛的功效。用于主治皮肤不仁、关节不遂、肢体麻木、风疹瘙痒等症。随着近年来研究的不断深入，关于蚕沙的化学成分、药理作用、临床应用的研究日益增多。现代研究表明，蚕沙具有改善和治疗贫血[1]、抗炎、镇痛、抑菌[2]、保肝作用[3]等多种药理活性，且对糖尿病患者血糖的改善也有一定疗效[4]。以蚕沙为原料提取的叶绿素、果胶、叶黄素、类胡萝卜素、植物醇、叶蛋白等，广泛用于食品、饮料、化妆品、医药等领域[5]，而关于蚕沙的微生物学研究较少。钟杨生等[6]研究了蚕沙堆肥过程中微生物群落数量的动态变化，史才娟等[7]研究了不同龄期蚕沙中细菌、真菌、放线菌的数量变化，但关于蚕沙中菌群的具体组成目前尚不清楚。

随着分子生物技术的发展，一些非培养型技术被用于肠道菌群、土壤菌群、植物内生菌等微生物群落结构的研究中，例如以16S rDNA为基础的DGGE[8]，Real timePCR[9]，FLSH[10]。近年来高通量测序技术已较为广泛地应用在微生物的研究中，是目前最为先进的检测技术，具备通量高、测序快、准确度高等特点。

本研究采用Illumina MiSeq第二代测序方法测定6种不同龄期烘干前后的蚕沙中菌群组成及丰富度，比较分析烘干加工前后、不同龄期蚕沙的菌群结构的差异性，同时对其代谢功能进行初步预测，以期为蚕沙药材品质及功能主治提供科学依据。

1材料与方法

11样品采集

所有蚕沙样品均采自镇江市江苏科技大学中国农业科学院蚕业研究所。采样时，在家蚕排便后，用无菌镊子收集粪便放入无菌袋中，取部分样品置于烘箱中50 ℃烘干备用，其余样品取样后立即用准备好的冰袋冷藏，并迅速转移到-80 ℃冰箱保存备用。

12试剂与仪器

RS232G紫外分光光度计；Eppendorf；DYY6C电泳仪；PCR仪2720；凝胶成像系统（BG）；台式紫外分析仪（BG）；Pico17离心機（Thermo）；Agilent，2100；BioTek，FLx800；Promega，QuantiFluorTBS380；Illumina Miseq高通量测序仪（Illumina）。

Millipore超纯水；琼脂糖（英杰公司，75510019）；EB溴化乙锭清除液（生工，EX328）；PowerSoil DNA提取试剂盒（美国MoBio，12888）；5×反应缓冲液；5×High GC Buffer；脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP，10 mmol·L-1）；Axy Prep DNA Gel Extration kit试剂盒（Axygen，APGX500）；TruSeq Nano DNA LT Sample Prep kit试剂盒（FC1214001或FC1214002）；Agencourt AMPure XP Beads kit试剂盒（A63881）；QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit试剂盒（Invitrogen，P7589）；Agilent High Sensitivity DNA Kit试剂盒（Agilent，50674626）。

13蚕沙样品DNA的提取

将每种原始粪便样品解冻、混匀后，各取025 g样品进行DNA的提取。样品使用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit（12888）试剂盒提取DNA[11]，用08%的琼脂糖凝胶电泳进行分子大小判断，利用紫外分光光度计对DNA进行定量，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 mg·L-1 [12]。

1416S rDNAV4区的PCR扩增

以稀释后的基因组DNA为模板，使用带标签的16S rDNAV4 区特异引物520F （5′标签+GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG3′）和802R（5′TACNVGGGTATCTAATCC3′），使用高效和高保真酶（Q5高保真DNA聚合酶；5倍反应缓冲液；5倍高GC缓冲液）进行PCR扩增，确保扩增的效率和准确性。

15PCR 产物的混样和纯化

PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切取目的片段并用Axygen凝胶回收试剂盒回收目的片段。

1616S rDNA 文库构建与测序

161构建文库利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit试剂盒进行建库。首先对基因片段进行末端修复，将DNA 5′端突出的碱基切除，3′端缺失的碱基补齐，同时在5′端加上1个磷酸基团。在修复平整的DNA片段3′端引入单碱基“A”，从而防止DNA片段的自连，同时保证DNA与3′端有1个突出T碱基的测序接头相连。在连接酶的作用下，孵育含有标签的接头与DNA片段，使其相连。通过PCR扩增已经加上接头的DNA片段，利用BECKMAN AMPure XP beads试剂盒纯化PCR体系。利用2%琼脂糖凝胶电泳来对文库做最终的片段选择与纯化。构建好的文库取1 μL，在Agilent Bioanalyzer机器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库做2100质检，利用QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上对文库进行定量，合格后，使用MiSeq进行上机测序[1316]。endprint

162上机测序将样品DNA文库均一化至10 nmol·L-1后等体积混合。混好的文库逐步稀释定量至4～5 pmol·L-1后用Illumina MiSeq 测序仪测序。

17生物信息学分析

测序得到的原始数据（raw data），存在一定比例的干扰数据（dirty data），为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行筛查、处理和质量控制，得到高质量的有效数据（effective tags）[17]运用QIIME软件识别疑问序列。要求序列长度≥150 bp，且不允许存在模糊碱基N，剔除5′端引物错配碱基数>1的序列和含有连续相同碱基数>8的序列。利用QIIME软件调用USEARCH检查并剔除嵌合体序列。最后去除barcode及引物序列，使用UCLUST软件，按照97%相似性进行操作分类单位（operational taxonomic units，OTU）聚类，挑选出每个OTU的代表序列[18]。利用Greengene 数据库对代表序列进行物种注释。通过对OTUs进行丰度，Alphadeversity，Betadeversity，LefSe分析以及物种在各个分类水平上的群落结果统计分析，得到微生物群落结构组成[1920]。利用KEGG数据库通过PICRUSt软件对样品的群落代谢功能进行预测。

2结果

21测序结果的质量分析

蚕沙样品所测得的有效序列共274 750条，其中高质量序列259 250 条，占序列总数的9436%。长度分布在300～500 bp，长度为450 bp 的序列最多，有20多万条。从序列长度的分布来看，与16SrDNAV4 区序列长度吻合（表1）。

22OTU划分和分类地位鉴定

利用Mothur软件计算在97%的相似水平上每个样品的OTU数量，OTU的数量可以代表样品物种的丰度[21]。结果表明，在所有样品中，OTU数量最多可达到369，最少为243。这表明蚕沙样品的菌群丰富度很高，干品与鲜品之间菌群丰富度差异较大，不同龄期鲜品菌群丰富度明显高于干品，且样品均不存在未分类OTU（表2）。在门、纲、目水平上OTU几乎可以全部被检测，在属、种水平上被检测出的OTU的数量明显减少（图1）。

23Alpha多样性分析

231稀疏曲线利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例，模拟输入序列数目（小于总的样品序列条数）與OTU个数产出间的相互关系。对基于97%相似度归类的OTU用 Observed species，Chao1，Shannon 3种方法进行稀疏曲线（rarefaction curve）绘制（图2）。

从稀疏曲线来看，随着测序数量的增加，稀释曲线斜率逐渐降低，趋向平坦但未进入平台期，说明再增加测序数量也只会产生少量新的OTUs；从Chao1指数稀疏曲线来看（图2C），Chao1指数在0～2×104的测序数量范围内增幅最大，在2×104以后曲线斜率下降，且4LX，5LX 的chao1曲线的增幅十分相似，表明2种蚕沙样品菌群丰富度相似；从Shannon指数稀疏曲线来看（图2B），6种蚕沙样品的曲线数值先是直线上升直至趋向平坦，说明测序量足够大，能覆盖样品中绝大多数微生物信息，再增加测序深度蚕沙样品的菌群多样性也不会发生改变。4LG蚕沙的3种曲线均明显短于其他样品组，说明测序数量足够，已达到全部覆盖。烘干后蚕沙样品的菌群的丰富度及多样性均有明显下降，五龄蚕沙受烘干的影响较大，烘干处理可明显降低五龄蚕沙的菌群多样性与丰富度。

232Alpha多样性指数对OTU丰度矩阵中的全体样品根据最低测序深度统一进行随机重抽样（即“序列量拉平处理”），使用QIIME软件分别对每个样品计算chao1，ACE，Shannon指数（表3）。

由表3可知，烘干后蚕沙样品中chao1，ACE指数随着龄期的增加而逐渐降低，说明干蚕沙随着龄期的增加菌群的丰富度逐渐降低；新鲜蚕沙chao1，

ACE指数增长趋势与其相反，说明随着龄期的增加新鲜蚕沙的菌群丰富度逐渐升高。Shannon指数在烘干前、后的蚕沙样品中均随着龄期的增大而呈下降趋势，说明龄期增大，蚕沙菌群的多样性有所下降。

24各分类水平的分类学组成分析

241门水平的群落分类学组成分析蚕沙主要由变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、蓝细菌Cyanobacteria组成。其中相对丰度最大的优势菌门为变形菌门Proteobacteria，高达90%。烘干处理前后的放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes丰度差异较大（图3）。

242属水平上的各样品群落构成分析除变形菌门肠杆菌科未分类菌属（Enterobacteriaceae，759%），蚕沙细菌主要分布于以下10个属，苍白杆菌属（Ochrobactrum，41%）、节细菌属（Arthrobacter，37%）、不动杆菌属（Acinetobacter，35%）、肠球菌（Enterococcus，20%）、葡萄球菌属（Staphylococcus，16%）、农杆菌属（Agrobacterium，07%）、甲基杆菌属（Methylobacterium，06%）、克雷白氏杆菌属（Klebsiella，05%）、肠杆菌属（Enterobacter，04%）、沙雷氏菌属（Serratia，03%）。3LG蚕沙的节细菌属Enterococcus含量明显高于其他；4LG，4LX，5LX的苍白杆菌属Ochrobactrum含量较高；5LG的肠球菌属Enterococcus含量较高；4LG，3LG的不动杆菌属Acinetobacter含量较高（图4）。使用R软件，对丰度前50位的属进行聚类分析并绘制热图，热图中每小格代表所在样品中某种菌的相对丰度，颜色越红代表相对丰度越高。在属水平上，4LX与5LX、3LG与3LX、4LG与5LG的菌群内部结构较相似，可分别聚为一类（图5）。endprint

25Beta多样性分析

基于UniFrac[22]距离上对属水平各样品之间进行加权（weighted）和非加权（unweighted）的主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA），同时采用基于UniFrac的非加權组平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）进行样品聚类。6种样品微生物群落构成的PcoA图中，坐标轴括号中的百分比代表了对应的主成分所能解释的原始数据中差异的比例（图6），基于UniFrac的加权和非加权的主坐标分析（weighted and unweighted UniFrac principal coordinate analysis）其第一主成分和第二主成分的贡献率分别为4423%，1811%和5535%，3204%。说明在加权和非加权主坐标分析中所选主成分均可以充分解释原始数据中的差异。通过图中样品点距离的远近，可观察个体或群体间的差异，样品点越相近说明样品间微生物群落构成越相似。由基于UniFrac的非加权主坐标分析图（图6A）和基于UniFrac的加权主坐标分析图（图6B）可知，3LG，3LX始终处于同一象限，说明三龄蚕沙样品在烘干前后菌群多样性无明显改变，烘干处理对其影响较小。这点在UPGMA聚类图中（图7）也得到印证。4LX与5LX无法同其他样品聚为一簇（图7），这表明二者微生物群落结构相似而与其他样品相差较大，烘干对四龄、五龄蚕沙样品有显著影响。

26LefSe分析

LefSe分析，根据分类学组成对样品按照不同的分组条件进行线性判别分析，找出对样品划分产生显著性差异影响的群落[2325]。将蚕沙样品分为2组，烘干处理前与烘干处理后，以P<05，LOD>2为标准，在各分类水平找出具有显著性差异的群落。柱形图表示在2组中的差异菌属信息，红色表示在烘干处理蚕沙组中高出，绿色表示在新鲜蚕沙组中高出；所有菌在门、纲、目、科、属，水平的差异信息用饼形图表示。经LEfSe分析（图8），干蚕沙中的柠檬酸杆菌属Citrobacter、爱文氏菌属Ewingella显著高于新鲜蚕沙，新鲜蚕沙中的甲基杆菌属Methylobacterium、甲基杆菌科Methylobacteriaceae、链球菌科Streptococcaceae、蓝细菌（cyanobacteria）、芽孢杆菌属Bacillus和0319_6G20科菌（0319_6G20）显著高于干蚕沙。由分析结果可知，干蚕沙中的条件致病菌要少于新鲜蚕沙，相比于新鲜蚕沙，干蚕沙更适于入药。另干蚕沙中的柠檬酸杆菌属可发酵葡萄糖产酸产气，艾文氏菌属可发酵D阿拉伯糖、D纤维二糖产酸，提示蚕沙的降糖作用可能与蚕沙中的相关菌群的作用有关。

27群落代谢功能分析

通过PICRUSt[26]软件，根据KEGG数据库中微生物代谢功能的类别对群落样本的代谢功能进行预测。统计蚕沙菌群相对丰度大于005的相关代谢功能（表4），蚕沙菌群涉及的代谢功能主要有膜转运、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、核苷酸

3讨论

本文对6种不同龄期、烘干处理前后的蚕沙样品中菌群多样性进行分析与评价，对其16S rDNAV4区进行Illumina MiSeq平台测序，共得到274 750个有效序列。6种蚕沙样品的3种稀疏曲线数值先是上升直至趋向平坦，说明测序量足够大，能覆盖样品中绝大多数微生物信息。

蚕沙作为一种动物药，其本身为家蚕的排泄物，相对与传统的中药材，蚕沙中所含有的微生物较多。药典中关于中药制剂、生物制品等有相应的微生物限度要求[27]，这也提示对于蚕沙这类微生物含量较多的药材其菌群鉴定的必要性。本研究以蚕沙中的菌群结构为切入点，首先明确了蚕沙中菌群的组成和相对丰度，并从菌群结构的角度对中药材蚕沙的烘干处理进行了评价。从蚕沙样品在不同分类水平上的OTU数量，样品的chao1指数、ACE指数、shannon指数可明显的看出烘干处理后的蚕沙样品中菌群的丰度和多样性都低于新鲜蚕沙，芽孢杆菌、链球菌等一些条件致病菌在干蚕沙中也明显减少，充分说明烘干处理可有利于蚕沙药用。

在对蚕沙样品进行分类学鉴定时发现蚕沙主要由变形菌门Proteobacteria、厚壁菌门Firmicutes、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、蓝细菌Cyanobacteria组成。其优势菌门为变形菌门。各分类水平的菌群鉴定均显示3龄蚕沙的菌群多样性与结构同4龄、5龄蚕沙相差较大，原因是家蚕在1～3龄期为稚蚕，4～5龄期为壮蚕，分属家蚕生长发育的不同阶段，其肠道菌群本身的差别较大。此外，有报道[28]通过剖取家蚕肠道内容物进行16SrDNA测序，确定了家蚕肠道细菌的优势类群为葡萄球菌属、阴沟肠杆菌（肠杆菌属）、蜡样芽胞杆菌（芽孢杆菌属）。这与本研究所得的蚕沙菌群的优势类群有所不同，推测家蚕在食用桑叶的过程中体内的微生物系统发生了改变，可能有新的菌种产生。加之蚕沙中存在消化不完全的桑叶，导致蚕沙的菌群一部分来源于桑叶的内生菌，值得进一步深入研究。

结合对人肠道菌群的相关研究[29]可发现蚕沙的菌群结构与人体的肠道菌群结构差异较大，若服用不当其含有的条件致病菌极有可能破坏人体的肠道菌群平衡，从而不但达不到治病的效果反而会致病。本研究结果也提示，在蚕沙入药时要经过适当加工处理，鲜品不适于入药，三龄蚕沙不适于入药；同时充分考虑其可能对机体微生物生态环境产生改变，从而对机体产生影响。蚕沙菌群优势种属代谢功能的预测说明蚕沙对机体糖、脂肪、蛋白代谢有一定的影响，表明蚕沙的药效可能与其菌群的作用有关，尚需进一步深入研究。

本实验利用Illumina MiSeq 高通量测序技术分析了蚕沙菌群多样性，全面而准确地分析了蚕沙菌群的种类组成，发现蚕沙菌群分布相对集中，主要分布于肠杆菌科（Enterobacteriaceae，80%），以下7个种属为蚕沙菌群的优势种群：变形菌门下的苍白杆菌属Ochrobactrum、不动杆菌属Acinetobacter、节细菌属Arthrobacter、甲基杆菌Methylobacterium、肠杆菌属Enterobacter、克雷白氏杆菌属Klebsiella及厚壁菌门下的葡萄球菌Staphylococcus，为蚕沙的后续研究及开发利用提供了科学依据。endprint

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[责任编辑吕冬梅]endprint