LOX基因G473A多态性研究在结直肠癌患者肿瘤风险评估中的应用

厉金雷+蔡剑辉+任约翰+左志贵

[摘要] 目的 研究賴氨酰氧化酶（LOX）基因G473A多态性与结直肠癌易感性的关系，为结直肠癌肿瘤的风险评估提供依据。 方法 随机选择2010年5月～2014年8月我院收治的200例结直肠癌患者作为研究对象，并随机选择同期200例体检健康者作为对照组，分别抽取所有研究对象的肘静脉血5 mL和抽取基因组后对LOX基因G473A位点测序，检测各个体LOX基因G473A的基因型。然后采用Logistic回归分析不同LOX基因G473A基因型与结直肠癌患病风险之间的相关性。 结果 （1）结肠癌组GG、GA、AA基因型患者分别占47.37%（45/95）、41.05%（39/95）、11.58%（11/95）。携带GG基因型个体患结肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=1.71，95%CI=1.01～2.65，P=0.03；OR=3.94，95%CI=1.43～8.96，P=0.00）。（2）直肠癌组GG、GA、AA基因型患者分别占51.43%（54/105）、37.4%（39/105）、11.43%（12/105）。携带GG基因型个体患直肠癌的风险明显低于AA基因突变型个体（OR=3.45，95%CI=1.61～8.03，P=0.00）。（3）结直肠癌组GG、GA、AA基因型患者分别占49.50%（99/200）、39.00%（78/200）、11.50%（23/200）。携带GG基因型个体患结直肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=1.67，95%CI=1.01～2.18，P=0.03；OR=3.68，95%CI=1.81～7.65，P=0.00）。 结论 LOX基因G473A多态性与结直肠癌的发病风险有一定关系，行LOX基因G473A多态性检测在结直肠癌风险评估中具有一定的应用价值。

[关键词] 赖氨酰氧化酶；基因多态性；结直肠癌；肿瘤风险评估

[中图分类号] R735.3+5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）22-0001-05

[Abstract] Objective To study the relationship between the G473A polymorphism of lysyl oxidase（LOX） gene and the susceptibility of colorectal cancer， and to provide the basis for the risk assessment of colorectal cancer. Methods A total of 200 patients with colorectal cancer were enrolled in our hospital from May 2010 to August 2014.A total of 200 cases of normal physical examination were recruited as control group. All the subjects were given 5 mL of elbow vein blood. Genomic DNA was extracted from peripheral blood and the G473A locus of LOX gene was sequenced and the genotype was detected. Logistic regression was used to analyze the correlation between the G473A genotype of LOX gene and the risk of colorectal cancer. Results（1）The proportion of GG， GA and AA genotype in colorectal cancer group were 47.37%（45/95）， 41.05%（39/95）and 11.58%（11/95） respectively. The risk of colorectal cancer with GG genotype was significantly lower than that of GA and AA mutant individuals（OR=1.71， 95%CI=1.01～2.65， P=0.03； OR=3.94， 95%CI=1.43～8.96， P=0.00）.（2）The genotype of GG， GA and AA in rectal cancer group was 51.43%（54/105）， 37.4%（39/105） and 11.43%（12/105） respectively. The risk of rectal cancer with GG genotype was significantly lower than in AA mutant individuals（OR=3.45， 95%CI=1.61～8.03， P=0.00）.（3）The proportion of GG， GA and AA genotype in colorectal cancer group was 49.50%（99/200）， 39.00%（78/200） and 11.50%（23/200） respectively. The risk of colorectal cancer with GG genotype was significantly lower than that of GA and AA mutant individuals（OR=1.67， 95%CI=1.01～2.18， P=0.03； OR=3.68， 95%CI=1.81～7.65， P=0.00）. Conclusion The G473A polymorphism of LOX gene is associated with the risk of colorectal cancer. The detection of LOX gene G473A polymorphism has a certain value in the risk assessment of colorectal cancer.endprint

[Key words] LOX； Gene polymorphism； Colorectal cancer； Tumor risk assessment

结直肠癌是我国一种高发型肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势[1]。结直肠癌的早期症状并不明显，早期的结直肠癌患者很容易被误诊为肠道功能障碍，往往确诊时已经处于晚期阶段，且多发生血管和淋巴结转移[2，3]。因此，早期诊断和检测对于患者的治疗具有非常重要的意义。大量研究表明在结直肠癌的发病过程中遗传因素非常关键，然而结直肠癌的发病机制目前并没有完全明确[4，5]。赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）是在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中催化弹性蛋白和胶原聚合发生交叉联结的一种酶，增强ECM的稳定性[6]。临床研究显示，LOX与肿瘤的关系密切，LOX基因表达的RNA和蛋白在众多肿瘤中均有所下调，而在其他一些恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌等肿瘤的特殊发展时期的表达量显著升高，促进肿瘤的侵袭和转移[7，8]。据研究显示LOX基因多态性与结直肠癌的发生具有一定的联系[9]，本研究以我院收治的200例结直肠癌患者作为研究对象，分析LOX基因G473A多态性与结直肠癌发病风险的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择2010年5月～2014年8月我院收治的200例结直肠癌患者作为研究对象设为结直肠癌组，所有结直肠癌患者均经过病理学确诊，患者的年龄、性别、病例分期均不限，所有患者的临床资料均完整，抽取每位患者的空腹静脉血5 mL，抽血前确认患者没有接受过放化疗治疗。根据所选择的结直肠癌患者的年龄、性别等一般资料匹配选择200例在我院体检的健康者作为对照组。200例结直肠癌患者中结肠癌组95例，根据该患者的年龄、性别等一般资料从对照组中匹配选择95例作为对照组1；直肠癌组患者105例，根据该患者的年龄、性别等一般资料从对照组中匹配选择105例作为对照组2。所有研究对象均不存在家族肿瘤史。本研究获得了我院医学伦理委员会的批准，所有参与本研究的对象均签署了知情同意书。

1.2 方法

（1）所有研究对象均抽取肘静脉血5 mL左右，采用Qiagen血液DNA提取试剂盒（Qiagen 51104）抽提血液中DNA，80 μL洗脱后-80℃保存。（2）设计LOX的G473A多态性检测的PCR扩增引物。上游引物为5-TTCCAAGCTGGCTACTCGAC-3；下游引物为5-CAGGTCTGGGCCTT-TCATAA-3[10]。（3）PCR扩增。反应体系为25 μL，其中5 μM的上下游引物各1 μL，2.5 μL的10×PCR buffer，0.8 μL MgCl2（50 mM），0.5 μL dNTP（10 mM），上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL（PCR反应试剂购于金斯瑞生物科技，产品编号E00007-1000）。PCR反应条件为94℃，5 min；变性94℃，30 s；退火57℃，40 s；延伸72℃，30 s；35个循环，72℃，5 min，4℃保存。PCR扩增后送杭州九洋生物科技有限公司测序。测序完成后采用Chromas软件分析。

1.3 研究方案

结肠癌组的年龄界限为61岁，直肠癌组和结直肠癌组的年龄界限为59岁。分别统计结肠癌组和对照组1年龄<61岁、≥61岁、男性、女性、吸烟与不吸烟例数；直肠癌组和对照组2年龄<59岁、≥59岁、男性、女性、吸烟与不吸烟例数。根据测序结果统计分析各组GG型、GA型、AA型基因人数，分析各基因型与结直肠癌患者年龄、性别和吸烟状态的相关性。

1.4 统计学方法

本研究数据的统计学分析采用SPSS 20.0统计学分析软件，结肠癌组与对照组1、直肠癌组与对照组2、结直肠癌组与对照组的基因型频数分别进行Hardy-Weinberg平衡检验，P>0.05表示所选样本人群的基因频率符合遗产平衡法则，具有代表性。计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。采用多变量Logistic回归分析计算OR值和95%CI，分析结直肠癌的发病风险，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

结肠癌组、直肠癌组及结直肠癌组患者与各自对照组之间的年龄组成、性别比例和吸烟状态之间比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1～3。

2.2 结直肠癌患者与对照组之间LOX的G473A基因多态性分布

结直肠癌组患者与各自对照组的LOX G473A基因多态性分布情况见表4，各基因型测序结果见封三图1。分别对结肠癌、直肠癌、结直肠癌患者与各对照组进行Hardy-Weinberg平衡检验，P>0.05说明所选样本人群的基因频率符合遗产平衡法则，具有代表性。结肠癌、直肠癌、结直肠癌患者与各对照组之间不同G473A基因型之间的差异有统计学意义（P<0.05）。采用多变量Logistic回归分析结果显示，携带GG基因型个体患结肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=1.71，95%CI=1.01～2.65，P=0.03；OR=3.94，95%CI=1.43～8.96，P=0.00）。携带GG基因型个体患直肠癌的风险明显低于AA基因突变型个体（OR=3.45，95%CI=1.61～8.03，P=0.00）。携带GG基因型个体患结直肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=1.67，95%CI=1.01～2.18，P=0.03；OR=3.68， 95%CI=1.81～7.65，P=0.00）。

2.3 LOX基因G473A等位基因的多态性與结直肠癌患者年龄、性别和吸烟状态的相关性

结肠癌组患者中年龄<61岁患者、女性患者和吸烟的患者携带GG基因型个体患结肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=3.01，95%CI= 1.19～9.21，P=0.01；OR=2.35，95%CI=1.04～4.32，P=0.02；OR=3.55，95%CI=1.22～9.32，P=0.02）。直肠癌组患者中女性患者和不吸烟的患者携带GG基因型个体患直肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=2.04，95%CI=1.21～3.92，P=0.01；OR=1.71，95%CI=1.11～2.53，P=0.02）；结直肠癌组患者中年龄<59岁患者、≥59岁、女性患者和不吸烟的患者携带GG基因型个体患结直肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=1.73，95%CI=0.98～2.47，P=0.04；OR=1.72， 95%CI=1.01～2.62，P=0.02；OR=2.22，95%CI=1.27～3.83，P=0.00；OR=1.78，95%CI=1.19～2.53，P=0.00）。见表5。endprint

3 讨论

结直肠癌（colorectal，CRC）是一种常见的恶性肿瘤，近年来随着我国居民生活水平的上升以及饮食习惯的改变，结直肠癌的发病率逐渐上升。结直肠癌的预后与早期诊断密切相关，早期结直肠癌的5年生存率高达90%，而晚期结直肠癌的生存率不到10%[11]。结直肠癌的早期诊断的主要方法是内镜[12]，目前我国结直肠癌的早期诊断率明显低于欧美发达国家[13]。因此，提高我国结直肠癌的早期诊断率，降低结直肠癌的死亡率对于提高我国居民健康水平具有重要的意义。

赖氨酰氧化酶（LOX）是由纤维细胞分泌的铜依赖性酶，引发胶原和弹性蛋白的交联，稳定细胞外基质（ECM），增加的LOX活性与纤维化疾病如肺和肝纤维化和动脉粥样硬化有关[14]，而LOX活性降低与动物模型中的硫酸盐诱导性肺气肿和铜代谢障碍（如Menkes综合征）有关，因此，LOX在器官形态发生和组织修复中起着重要作用[15]。最近，LOX已经显示出在癌发生中具有双重功能。作为肿瘤抑制因子，其抑制H-ras诱导的肿瘤发生[16]，而作为肿瘤增强剂，其在缺氧条件下促进肿瘤转移[17]。LOX可以氧化除胶原蛋白和弹性蛋白以外的各种球状蛋白质中的赖氨酸残基[14]。通过LOX氧化碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）阻断bFGF刺激的细胞和具有高致瘤潜力的bFGF-自分泌转化细胞的增殖[18]。纯化的成熟牛LOX显示单核细胞和血管平滑肌细胞的趋化活性[19]。因此，LOX是一种执行多重生物功能的关键细胞内和细胞外效应物。据研究显示，结直肠癌的发病风险与其遗传因素具有一定的相关性，其中LOX基因的G473A位点的多态性是相关肿瘤的高风险因素[20]。LOX基因位于人类第5号染色体上，LOX基因家族共有5个成员，分别为LOX、LOXL、LOXL2、LOXL3和LOXL4，各家族的不同在于其N末端的差异导致其在发育、衰老以及调控肿瘤的生长发育方面发挥的作用具各不相同[21]。有研究显示LOX基因的多态性位点众多，分别分布于非编码区、编码区以及基因间区，非编码区的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）主要影响基因片段与转录因子的结合等，编码区的SNP主要是改变氨基酸的序列[22]，研究显示这些SNP能够提高机体对药物、环境以及相关致病因子的敏感性，从而增加患癌的风险[23]。LOX基因SNP中，G473A是一个非常重要且频发的SNP，473位点处的G突变为A，导致多肽的精氨酸158突变为谷氨酰胺，导致相关肿瘤的发生[23]。本研究结果显示，携带GG基因型个体患结肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=1.71，95%CI=1.01～2.65，P=0.03；OR=3.94，95%CI=1.43～8.96，P=0.00）。携带GG基因型个体患直肠癌的风险明显低于AA基因突变型个体（OR=3.45，95%CI=1.61～8.03，P=0.00）。携带GG基因型个体患结直肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=1.67，95%CI=1.01～2.18，P=0.03；OR=3.68， 95%CI=1.81～7.65，P=0.00）。LOX基因的G473A位点多态性在我国人群中比较常见，本研究结果显示，200例体检正常人中GG型占61.50%，GA型占34.50%，AA型占4.00%。结肠癌患者中GG型占47.37%，GA型占41.05%，AA型占11.58%。直肠癌患者中GG型占51.43%，GA型占34.29%，AA型占3.81%。可以明显看出结肠癌患者的G473A位点突变率较高，与相关研究结果一致[24]。另外，本研究分别调查了不同年龄阶段、不同性别以及是否吸烟等人群结直肠癌的发生风险，结果显示结肠癌组患者中年龄<61岁患者、女性患者和吸烟的患者携带GG基因型个体患结肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=3.01，95%CI=1.19～9.21，P=0.01；OR=2.35，95%CI=1.04～4.32，P=0.02；OR=3.55，95%CI=1.22～9.32，P=0.02）。直肠癌组患者中女性患者和不吸烟的患者携带GG基因型个体患直肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=2.04，95%CI=1.21～3.92，P=0.01；OR=1.71，95%CI=1.11～2.53，P=0.02）；结直肠癌组患者中年龄<59岁患者、≥59岁、女性患者和不吸烟的患者携带GG基因型个体患结直肠癌的风险明显低于GA和AA基因突变型个体（OR=1.73，95%CI=0.98～2.47，P=0.04；OR=1.72，95%CI=1.01～2.62，P=0.02；OR=2.22，95%CI=1.27～3.83，P=0.00；OR=1.78，95%CI=1.19～2.53，P=0.00）。通过这些结果可以为临床结直肠癌的防治和风险评估提供依据，同时也可以为结直腸癌的早期诊断和预防提高参考。

综上所述，LOX基因G473A多态性与结直肠癌的发病风险有一定关系，对LOX基因G473A多态性进行检测能为结直肠癌风险评估提供理论依据。

[参考文献]

[1] 李道娟，李倩，贺宇彤. 结直肠癌流行病学趋势[J]. 肿瘤防治研究，2015，42（3）：305-310.

[2] 柏愚，杨帆，马丹，等. 中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南（2014年，北京）[J]. 胃肠病学，2015，32（6）：345-365.

[3] 张彦斌，刘月，叶颖江，等. 结直肠癌相关肿瘤标志物的定量蛋白质组学研究[J]. 中华普通外科杂志，2016， 31（10）：839-842.

[4] 郜文秀，古小玲，骆菊英，等. NAT2基因多态性与大肠癌遗传易感性关系[J]. 中国公共卫生，2015，31（5）：645-647.endprint

[5] 李嬌元， 常江， 朱颖，等. 基于常见遗传变异和传统风险因素的中国南方汉族人群结直肠癌风险预测模型研究[J]. 中华流行病学杂志，2015，36（10）：1053-1057.

[6] Matsuura S，Mi R，Koupenova M，et al. Lysyl oxidase is associated with increased thrombosis and platelet reactivity[J]. Blood，2016，127（11）：1493.

[7] 高国政. LOX在肿瘤中的研究进展[J]. 实用检验医师杂志，2011，3（3）：181-183.

[8] 吴颖，杨继鑫，李南林，等. LOX家族与乳腺癌相关性研究进展[J]. 中华肿瘤防治杂志，2015，22（17）：1412-1416.

[9] 石晓明，吴胜春，杨永宾，等. 结直肠癌患者外周血赖氨酰氧化酶基因多态性及其临床意义[J]. 上海医学，2016，39（3）：160-163.

[10] Yoon JH，Park JK，Kang YH，et al. Lysyl oxidase G473A polymorphism is closely associated with susceptibility to gastric cancer in a South Korean population[J]. Apmis，2011，119（11）：762.

[11] Courtney RJ，Paul CL，Carey ML，et al. A population-based cross-sectional study of colorectal cancer screening practices of first-degree relatives of colorectal cancer patients[J]. BMC Cancer，2013，13（1）：1-11.

[12] 潘骏，柏愚，李兆申. 结直肠癌内镜筛查研究进展[J]. 中华消化内镜杂志，2015，32（10）：707-710.

[13] Carter JV，Galbraith NJ，Yang D，et al. Blood-based microRNAs as biomarkers for the diagnosis of colorectal cancer：A systematic review and meta-analysis[J]. British Journal of Cancer，2017，116（6）：762-774.

[14] Kagan HM，Li W. Lysyl oxidase：Properties，specificity，and biological roles inside and outside of the cell.[J]. Journal of Cellular Biochemistry，2003，88（4）：660.

[15] Kim Y，Peyrol S，So CK，et al. Coexpression of the lysyl oxidase-like gene（LOXL）and the gene encoding type Ⅲ procollagen in induced liver fibrosis[J]. Journal of Cellular Biochemistry，2015，72（2）：181-188.

[16] Kenyon K，Contente S，Trackman PC，et al. Lysyl oxidase and rrg messenger RNA[J]. Science，1991，253（5021）：802.

[17] Erler JT，Bennewith KL，Nicolau M，et al. Lysyl oxidase is essential for hypoxia-induced metastasis[J]. Nature，2006，440（7088）：1222-1226.

[18] Li W，Nugent MA，Zhao Y，et al. Lysyl oxidase oxidizes basic fibroblast growth factor and inactivates its mitogenic potential[J]. Journal of Cellular Biochemistry，2003，88（1）：152.

[19] Li W，Zhou J，Chen L，et al. Lysyl oxidase，a critical intra-and extra-cellular target in the lung for cigarette smoke pathogenesis[J]. International Journal of Environmental Research &Public Health，2011，8（1）：161-84.

[20] Wang G，Shen Y，Cheng G，et al. Lysyl oxidase Gene G473a polymorphism and cigarette smoking in association with a high risk of lung and colorectal cancers in a north Chinese population[J]. International Journal of Environmental Research & Public Health，2016，13（7）：635.

[21] Baker AM，Bird D，Welti JC，et al. Lysyl oxidase plays a critical role in endothelial cell stimulation to drive tumor angiogenesis[J]. Cancer Research，2013，73（2）：583.

[22] 王健. Survivin基因多态性与结直肠癌发病风险的相关性分析[J]. 中国医学创新，2016，13（14）：7-10.

[23] Pichu S，Sathiyamoorthy J，Vimalraj S，et al. Impact of lysyl oxidase（G473A） polymorphism on diabetic foot ulcers[J].International Journal of Biological Macromolecules，2017，25（103）：242.

[24] 沈艳青，林佳，程光，等. 赖氨酰氧化酶基因多态性与结直肠癌发病风险的相关性[J]. 中华消化杂志，2016， 36（1）：35-40.

（收稿日期：2017-05-11）endprint