绿色荧光裸小鼠动情周期的观察

胡文娟, 方 天, 陈 莉, 刘 彪, 梁 磊, 许龙祥, 恽时峰

(南京军区南京总医院比较医学科, 全军实验动物科普与伦理教育基地,全国科普教育基地, 南京 210002)

绿色荧光裸小鼠动情周期的观察

胡文娟, 方 天, 陈 莉, 刘 彪, 梁 磊, 许龙祥, 恽时峰

(南京军区南京总医院比较医学科, 全军实验动物科普与伦理教育基地,全国科普教育基地, 南京 210002)

目的 观察绿色荧光裸小鼠(GFP nu/nu)动情周期的变化。方法 采用阴道涂片法，连续15 d，分别对40只性成熟期未生育的雌性绿色荧光裸小鼠(GFP nu/nu)、绿色荧光杂合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非GFP nu/nu)及BALB/c杂合小鼠(非GFP nu/+)进行阴道涂片观察，计算规律动情周期发生率，记录动情周期各阶段阴道涂片特征及持续天数，作比较分析。 结果 绿色荧光裸小鼠及绿色荧光杂合小鼠的规律动情周期发生率分别为77.5%和82.5%，明显低于BALB/c裸小鼠及BALB/c杂合小鼠的90%及95%; 绿色荧光裸小鼠及绿色荧光杂合小鼠的动情周期总持续时间为7～8 d，而普通BALB/c裸小鼠和BALB/c杂合小鼠的持续时间为5～6 d (P＜0.05)，其中绿色荧光裸小鼠及绿色荧光杂合小鼠的动情前期、动情期、动情后期持续时间与普通BALB/c裸小鼠的持续时间相差较大(P＜0.05)。结论 通过阴道涂片法可以确认绿色荧光裸小鼠所处的动情周期阶段，为后期在不同的动情周期内研究雌性绿色荧光小鼠生殖功能提供可靠的实验数据，提高实验操作的准确性。

绿色荧光; 动情周期; 阴道涂片; 生殖功能

绿色荧光蛋白(GFP)现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一。绿色荧光裸小鼠是将GFP基因导入BALB/c 裸小鼠而得来[1]。本科室自建立绿色荧光转基因裸鼠以来，对该品系鼠进行了多项研究，测定了主要的生理生化指标及部分免疫学指标, 检测了主要脏器质量和脏器系数,并研究了在主要组织中荧光蛋白的分布特点[2-5]。在日常繁育中，观察到绿色荧光裸小鼠繁殖性能较为低下，对雄性绿色荧光裸小鼠研究显示，该品系雄性小鼠精子质量低下可能导致了繁殖性能的下降[6]。作者推测GFP基因可能对雌性小鼠的生理功能也产生影响。因在实际生产操作中，大多采用雄性纯合子(GFP nu/nu)与雌性杂合子(GFP nu/+)交配，故本实验连续15 d对性成熟期未生育的雌性绿色荧光裸小鼠(GFP nu/nu)、绿色荧光杂合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非 GFP nu/nu)及 BALB/c杂合小鼠(非GFP nu/+)分别进行阴道涂片观察，以确定雌性绿色荧光裸小鼠的规律动情周期[7](动情前期、动情期、动情后期、动情间期)发生率以及动情周期各阶段的阴道涂片特征及持续天数，为后期在不同动情周期内研究GFP是否对绿色荧光裸小鼠生殖功能产生影响，提高实验操作的准确性。

1 材料与方法

1.1 实验动物、器材与试剂

分别取未生育的8～10周龄SPF级雌性绿色荧光裸小鼠(GFP nu/nu)、绿色荧光杂合小鼠(GFP nu/+)、BALB/c裸小鼠(非GFP nu/nu)及BALB/c杂合小鼠(非GFP nu/+)各40只，绿色荧光裸小鼠及杂合子为本科室提供[SCXK(军)2012-0014]，BALB/c裸小鼠及杂合子购于常州卡文斯实验动物有限公司[SCXK(苏)2011-0003]。四组动物均在SPF级设施饲养[SYXK(军）2012-0047]。光学显微镜、载玻片、医用棉签、生理盐水。

1.2 方法

将40只雌性绿色荧光裸小鼠、绿色荧光杂合小鼠、BALB/c裸小鼠及BALB/c杂合小鼠分别编号，于每日清晨8∶00～8∶30检测小鼠动情周期。用左手食指和拇指捏住小鼠尾，余下三指轻轻按压小鼠后腰背部，将其固定在操作台上，翻起尾暴露阴道口，用浸润了生理盐水的医用消毒棉签缓缓插入小鼠阴道内0.5～1 cm，转动2～3周，蘸取脱落细胞，并将其均匀涂在载玻片上[8]。对涂片采用美兰染色，于光学显微镜下观察阴道脱落细胞，记录小鼠动情周期变化情况。

根据文献[9]方法判断动情周期各个阶段：动情前期阴道脱落细胞以体积较大的有核上皮细胞为主；动情期阴道涂片多为无核的角化上皮细胞，像落叶一样堆积在一起; 动情后期兼有白细胞，有核上皮细胞与无核角化细胞，三种细胞数量无明显差别; 动情间期以白细胞为主。

1.3 统计学处理

记录实验数据，计算规律动情周期发生率(%)=(发生规律动情周期的小鼠数/总实验小鼠数)×100%[10]; 采用SPSS 软件对记录的动情周期变化维持时间进行统计学处理，数据以x-± s表示, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 规律动情周期发生率

实验表明，31只绿色荧光裸小鼠出现规律的动情周期，9只并未出现动情周期或动情周期极为不规律，即绿色荧光裸小鼠的规律动情周期发生率为77.5%(31/40)。绿色荧光杂合小鼠、BALB/c裸小鼠和BALB/c杂合小鼠的规律动情周期发生率分别为 82.5%(33/40)、90.0%(36/40)和 95.0%(38/40)

2.2 动情周期脱落细胞观察

镜下观察显示，绿色荧光裸小鼠的动情周期脱落细胞情况与其他几组小鼠并无明显差异，故只附上绿色荧光裸小鼠的镜下照片以供观察。动情前期： 阴道分泌物中大多为膨大的有核上皮细胞，呈椭圆形，白细胞较少(图1A); 动情期： 多为无核的角化上皮细胞，外形不规则，成堆聚集在一起呈落叶状(图1B); 动情后期： 白细胞开始增多，有核上皮细胞及无核角化上皮细胞均可见(图1C); 动情间期： 以白细胞为主，偶见一些有核上皮细胞细胞总数较少(图1D)。

2.3 动情周期各阶段

绿色荧光裸小鼠动情周期持续时间为(186.27±22.72) h, 其余3组小鼠的持续时间分别为(184.49±14.12) h、(131.12±18.87) h(P＜0.05)和(133.95±20.04) h(P＜0.05)。四组小鼠各阶段所占时间见表1绿色荧光裸小鼠及绿色荧光杂合小鼠的动情前期动情期和动情后期持续时间与BALB/c裸小鼠存在明显差异(P＜0.05); BALB/c杂合小鼠与BALB/c裸小鼠在动情周期中并无统计学差异。

3 讨论

表 1 四组小鼠动情周期各阶段持续时间 h

研究GFP基因对小鼠生殖功能的影响，了解动情周期是个关键问题之一。因此，确定雌性绿色荧光小鼠所处动情周期的阶段及各阶段所持续的时间，可提高后期实验的准确性，使研究更为科学可靠。阴道涂片法是目前常用的动情周期判定方法之一，常见的3种细胞分别为角化上皮细胞、有核上皮细胞以及白细胞，细胞形态易区分[11]，所以采用此法判断动情周期简易实用。

本实验连续15 d分别对40只性成熟期未生育的雌性绿色荧光裸小鼠、绿色荧光杂合小鼠BALB/c裸小鼠及BALB/c杂合小鼠分别进行阴道涂片观察, 结果显示, 雌性绿色荧光裸小鼠及绿色荧光杂合小鼠的规律动情周期的发生率分别为77.5%和82.5%，明显低于对BALB/c裸小鼠及BALB/c杂合小鼠的规律动情周期发生率(90.0%和95.0%)。出现规律动情周期的绿色荧光裸小鼠及绿色荧光杂合小鼠，其动情周期总持续时间为7～8d，而普通BALB/c裸小鼠和BALB/c杂合小鼠的持续时间为5～6 d (P＜0.05), 其中绿色荧光裸小鼠及绿色荧光杂合小鼠的动情前期、动情期、动情后期持续时间与普通BALB/c裸小鼠的持续时间相差较大(P＜0.05)，而动情间期持续时间无明显差异。本文绿色荧光裸小鼠的动情周期与李娟等[12]对BALB/c小鼠动情周期观察结果比较也存在较为明显差异。

图1 绿色荧光小鼠阴道涂片脱落细胞

研究表明[13]，在动情间期，雌激素含量低，孕酮含量高; 在动情前期，雌激素分泌开始增加，但是对阴道上皮的刺激作用仍然很低; 动情期，雌激素水平达到阙值; 动情后期是动情期向动情间期的过渡。雌性小鼠生殖周期的变化主要通过丘脑下部、垂体前叶和卵巢分泌的激素进行调节。通过阴道脱落细胞涂片法观察动物动情周期的变化能够合理地反映卵巢活性及其分泌性激素的能力。动情周期的紊乱是反应性激素代谢失调的敏感指标[14]。GFP基因可能对小鼠的激素调控基因表达方面造成影响，从而改变了雌性绿色荧光裸小鼠的激素水平，使激素代谢失调可能导致动情周期的变化，为确认此推测，后续将进一步研究雌性绿色荧光裸小鼠的生殖功能，包括脏器系数、激素水平等。

本实验通过阴道涂片法对雌性绿色荧光裸小鼠、绿色荧光杂合小鼠、BALB/c裸小鼠及BALB/c杂合小鼠的规律动情周期发生率以及动情周期各阶段的阴道涂片特征及持续天数进行了观察，为后期在不同的动情周期内研究雌性绿色荧光裸小鼠生殖功能提供可靠的实验数据，提高实验操作的准确性; 进一步找出绿色荧光裸小鼠繁殖性能下降的原因，也有助于将绿色荧光裸小鼠更好、更为广泛地运用于科学实验。

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Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0300-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.009

2017-02-09

胡文娟(1990-), 女, 技师, 本科, 从事荧光裸小鼠的育种与科研。E-mail： 452665670@qq.com

恽时锋(1965-), 男, 教授, 从事医学实验动物学专业。E-mail： yunshifeng1@163.com