氧化苦参碱对小鼠哮喘模型保护作用的初步研究

2017-09-08 05:59兰露莎赵兵兵杨红宇贵州医科大学实验动物中心贵阳550004
实验动物与比较医学 2017年4期
关键词:苦参碱计数炎性

兰露莎, 赵兵兵, 杨红宇, 罗 红, 江 滟(贵州医科大学实验动物中心, 贵阳 550004)

氧化苦参碱对小鼠哮喘模型保护作用的初步研究

兰露莎, 赵兵兵, 杨红宇, 罗 红, 江 滟(贵州医科大学实验动物中心, 贵阳 550004)

目的 初步探讨氧化苦参碱(OMT)对哮喘小鼠的保护作用。方法 用Al(OH)3和卵清白蛋白诱发BALB/c小鼠过敏性哮喘,每日观察小鼠一般情况和体质量变化。哮喘模型建立后,予OMT或地塞米松进行治疗,分别在治疗后5 d、15 d处死部分小鼠,留存肺组织和支气管肺泡灌洗液进行检测。将留存的肺组织行HE染色观察其病理变化,BALF预处理后瑞氏染色行细胞总数和嗜酸性粒细胞计数。结果 OMT介入可改善哮喘小鼠体质量降低,在治疗后5 d和15 d时,各治疗组肺组织亦出现与哮喘模型组相似的病理变化,但炎性细胞或嗜酸细胞浸润不同程度减少。OMT的各治疗组与哮喘模型组比较,BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞计数均降低(P<0.05或P<0.01)。结论 氧化苦参碱对哮喘小鼠具有治疗作用。

氧化苦参碱(OMT); 哮喘; 病理变化; 保护作用; 小鼠

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞, 包括炎性细胞、气道结构细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症[1]。反复发作可引起气道重塑, 导致不可逆气流受限,其原因与气道慢性炎症间接引起气道壁结构改变有关,被称为是哮喘的一个重要特征[2]。目前对于哮喘的治疗仍以糖皮质激素为主,但副作用较大。尚缺乏疗效满意且副作用小的抑制气道炎症及抗气道高反应性药物[3]。氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)又名苦参素,是从豆科属植物苦参或平科植物广豆根中分离出来的生物碱。OMT具有调节免疫、抗病原体、抗炎性反应等广泛的药理作用[4],并被临床证实具有一定的抑制气道炎症及抗气道高反应性作用,但机制不详。因此,本文通过OMT对建立的小鼠哮喘模型的介入初步探讨OMT防治支气管哮喘的治疗作用。为拓宽OMT在临床治疗哮喘疾病的应用,以及开发该药的新用途提供实验室依据,并为进一步探明OMT的作用及其作用机制等提供良好的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雌性BALB/c小鼠,54只,4~6周龄,体质量18~24 g,购自贵州省实验动物工程中心[SCXK(黔)2012-001],饲养于贵州医科大学实验动物中心屏障系统[SYXK(黔)2012-001]。

1.2 主要试剂和仪器设备

质量分数2% Al(HO)3凝胶佐剂(Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant),购自美国InvivoGen公司,10 mg/mL(Cat. Code: vac-alu-250, Lot #5113,Expiry date, Mar. 2017); 卵清白蛋白(Albumin from chicken egg white, OVA),购自美国Sigma公司,A5378-1G(Lot #SLBD2313V, PCode 1001988500,CAS 9006-59-1); 注射用地塞米松磷酸钠,购自马鞍山丰原制药有限公司, 5 mg/支, 批号150512-1。用无菌蒸馏水溶解稀释; 药物: OMT,购自中国药品生物检定所,为国家药品标准物质,批号110780-201007; 苏木素伊红(HE)染色试剂盒,购自碧云天生物技术有限公司,C0105; 瑞氏染液购自北京索莱宝公司,G8220。小动物屏障系统和IVC笼具(FRI-42),购自重庆腾鑫生物技术有限公司; 医用雾化器(402B)江苏鱼跃医疗设备股份有限公司; 倒置显微镜(CKX41)日本Olympus公司。

1.3 小鼠哮喘模型的建立

根据文献[5]方法并予以改进建立哮喘模型: 实验1 d、8 d、15 d腹腔注射OVA及Al(HO)3凝胶混合液 0.2 mL(内含 OVA 60 μg 及 2.25 mg Al(HO)3凝胶)致敏; 实验21 d开始用5% OVA溶液8 mL行超声雾化,每次30 min, 连续雾化5 d进行激发。通过观察小鼠是否出现烦躁、呼吸急促、抽搐及口唇紫绀等症状,支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数和肺组织病理变化情况,以验证建模是否成功。

1.4 OMT治疗哮喘小鼠的实验分组

54只小鼠随机分为6组,每组9只: ①正常对照组(CON), 用生理盐水代替OVA进行致敏和雾化,不给药; ②哮喘模型组(AST),按上述方法进行致敏和激发, 不给药; ③治疗对照组(TRE), 按上述方法进行致敏和激发,于每次激发前30 min腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg); ④OMT高剂量组(OMT-H)、中剂量组(OMT-M)和低剂量组(OMT-L), 按上述方法进行致敏和激发, 于每次激发前30 min分别腹腔注射OMT 25 mg/kg、12.5 mg/kg和6.25 mg/kg。于治疗后5 d每组处死小鼠3只,同时①摘眼球取血并制备血清冻存于-20 ℃; ②从气管注射无菌生理盐水 0.5 mL入肺,抽吸3次后将抽出液体即BALF冻存于-20 ℃; ③称小鼠体质量并记录; ④取右下肺叶置于质量分数4%多聚甲醛中固定; ⑤余下肺组织冻存于-80 ℃。各组小鼠不再激发,隔日给予相应药物1次,持续5次后,处死小鼠,留存标本及相应检查同前。

1.5 BALF 细胞计数

取150 μL BALF细胞悬液与细胞计数液按1∶1稀释混匀,显微镜下计数细胞总数,余下BALF在4 ℃、以2 000 r/min离心10 min,取沉淀物涂片,瑞氏染色后在显微镜下观察,每个标本计数200个细胞,共观察10个视野计数。

1.6 肺组织切片HE染色观察

质量分数4%多聚甲醛固定24 h后的肺组织按常规病理学方法进行石蜡包埋、切片及HE 染色,显微镜下观察并留存图像。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠一般情况及体质量观察

每日观察小鼠一般情况,并称各组小鼠的体质量。在致敏阶段,各组小鼠一般情况均好,无明显差别。开始激发后,AST、TRE、OMT-H OMT-M和OMT-L组小鼠均出现烦躁、精神萎靡进食减少、腹肌抽搐和口唇发绀等变化,各组间无明显差异。AST组小鼠体质量较CON组下降其他治疗组小鼠体质量介于二者之间(图1)。

2.2 BALF 细胞计数

AST组小鼠在激发后5 d或15 d,BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞计数较正常组都显著增高(P<0.01)。使用地塞米松或OMT的各治疗组与AST组比较,BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞计数均降低(P<0.05或P<0.01,表1)。

2.3 肺组织切片HE染色观察结果

HE染色片可见,CON 组气管、肺组织中无明显病理改变,肺泡、小血管、支气管等结构完整(图2A); AST组肺组织中肺大泡形成,肺充血肺泡内出现泡沫样渗出物,间质水肿,可见淋巴细胞、单核细胞浸润;肺组织中气道上皮增厚管腔狭窄,肺间质出现淋巴细胞和嗜酸细胞浸润气管壁和肺泡周围无炎性浸润(图2B)。各治疗组亦出现于AST组相似的病理变化,但炎性细胞或嗜酸细胞浸润不同程度减少(图2C、D、E和F)。

3 讨论

哮喘是一种世界范围的呼吸道常见疾病,近年来,哮喘的发病率在世界范围内呈上升趋势造成的社会负担不断增加[6]。已知哮喘是由多种细胞,包括炎性细胞、气道结构细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症[7]。哮喘会引起支气管壁出现炎性增厚改变,肥大细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞的活性增加,使肺组织开始出现纤维化,肺泡和肺间质就会随着纤维化不断受损,哮喘患者就会出现呼吸困难、心律失常等一系列呼吸衰竭症状,还会导致哮喘猝死、肺心病等病症[8]。但是,关于哮喘确切的发病机理目前尚不清楚,目前的治疗措施难以取得满意效果。

图1 各组小鼠体质量变化情况

表 1 BALF细胞总数和嗜酸性粒细胞计数(n=3) 109/L

图2 OMT治疗5 d哮喘小鼠肺组织病理观察(HE×200)

苦参碱来源于豆科植物苦参等,药理作用广泛,尤其在哮喘病的应用方面受到关注。OMT是豆科槐属植物中提取的一种生物碱,其结构中均具有四环的嗪啶。它是一类具有苦参次碱-15-酮化学结构的化合物,具有多方面的药理活性[9-14]。本文研究结果表明,OMT能有效改善哮喘动物模型的一般情况, 对抗哮喘动物模型肺组织炎性细胞浸润,肺组织炎性反应得到明显改善。这为OMT治疗哮喘奠定了一定的中医理论基础。OMT减轻肺组织炎症反应的机制,以及对抗气道高反应性和肺组织纤维化进行调节是我们需要进一步关注的问题。

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The Protective Effect of Oxymatrine on Asthma Mice

LAN Lu-sha, ZHAO Bing-bing, YANG Hong-yu, LUO Hong, JIANG Yan
(Experimental Animal Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

Objective To study the protective effect of Oxymatrine (OMT) on asthma mice.Methods The asthmatic BALB/c mice were induced by ovalbumin (OVA) and aluminium hydroxide.The general situations and weights of mice were observed every day. Then these mice were treated by using OMT and/or dexamethasone and were sacrificed at 5 or 15 days after treatment. The bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue of mice were obtained. Their pathological reaction was observed through HE stain. The total number of cells and eosinophilscells in BALF were counted. Result OMT can improve the weights of asthma mice. On day 5 and 15, the pathological reactions of the lung tissue in each treatment groups were the same with that of the asthma group, but the number of inflammatory cells in lung tissue was much less than that of the asthma group. The total number of cells and eosinophils cells in BALF were reduced compared with the asthma group (P<0.05 or P<0.01). Conclusion OMT has protective effect on the asthma mice.

Oxymatrine(OMT); Asthma; Pathological changes; Protection; Mice

Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0320-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.013

2017-05-30

贵州省科技厅省科技合作计划项目(黔科合LH字[2016]7369)

兰露莎(1984-), 女, 硕士研究生, 实验师。E-mail: 1558809668@qq.com

江 滟(1976-), 女, 医学博士, 教授, 从事病毒致病机制及抗病毒免疫相关研究。E-mail: jiangyan3313@sina.com

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