柘木提取物抗胃肠道肿瘤的免疫机制研究

谢家骏, 张国明, 乔正东, 陆宏祺, 严惠芳, 成 苗

(1. 上海中医药大学, 上海201203; 2.上海市中药研究所, 上海201400; 3. 上海雷允上药业有限公司,上海201400; 4. 上海市浦东医院, 201399; 5. 上海医药工业研究院, 上海201203)

柘木提取物抗胃肠道肿瘤的免疫机制研究

谢家骏1, 张国明2,3, 乔正东4, 陆宏祺5, 严惠芳5, 成 苗2,3

(1. 上海中医药大学, 上海201203; 2.上海市中药研究所, 上海201400; 3. 上海雷允上药业有限公司,上海201400; 4. 上海市浦东医院, 201399; 5. 上海医药工业研究院, 上海201203)

目的 观测柘木提取物对正常或荷瘤动物免疫功能变化的影响，探讨其抗癌作用机制。方法 给药后观察正常小鼠碳粒廓清能力和腹腔巨噬细胞吞噬功能，检测荷瘤小鼠淋巴细胞转化和自然杀伤(NK)细胞毒活性。结果 柘木提取物对正常小鼠碳粒廓清能力和腹腔巨噬细胞吞噬功能、对荷C26肠癌小鼠淋巴细胞转化和NK细胞活性均有增强作用，最低有效剂量均为0.3 g/kg，相当于柘木生药5.46 g/kg，为临床单日使用剂量的1.3倍。结论 柘木提取物对胃肠道肿瘤抑制作用机制与其对胃肠道肿瘤细胞的直接抑制作用以及提高机体特异性和非特异性免疫功能有关。

柘木提取物; 胃肠道肿瘤; 抗肿瘤作用; 免疫功能

柘木为桑科柘属植物柘树[Maclura tricuspidata Carrière,Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur. ex Lavallee]去皮后的干燥根和藤茎[1]。柘木性温味甘无毒, 具有清热凉血、舒筋活络的功效，近代民间有用其水煎液治疗癌症的报道[2]。20世纪中后叶, 柘木治疗胃肠道肿瘤的药品开发得到了广泛关注[3-5]。在作者先期研究中显示，柘木提取物对SGC-7901胃癌细胞和HCT-116肠癌细胞的生长均有抑制活性，对裸小鼠SGC-7901移植瘤和F1小鼠C26肠癌足趾重量均有减轻效果[6]。临床应用也证实柘木制剂对胃肠道肿瘤患者化疗或放疗有辅助治疗作用，并能改善病人的生活质量[7,8]。但有关柘木提取物治疗胃肠道肿瘤的免疫机制却少见有文献报道，为此，本文通过选用正常及荷瘤动物免疫功能检测方法对柘木提取物抑制胃肠道肿瘤的可能机制进行探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性F1 小鼠(BALB/c×ICR)，体质量18～20g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供[SCXK(沪)2002-0010]; 清洁级雄性ICR小鼠，体质量18～20 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供[SCXK(沪)2003-0002]。上述所有小鼠均分笼饲养(4～6只/笼)，饲以鼠用固体高压料，试验前禁食12h时，不禁水。

1.2 受试物

柘木提取物：柘木，切成小块，加水7倍，提取4 h，收取药液; 药渣加水5倍，提取3h; 合并二次提取液后减压浓缩至相对密度1.07(80 ℃)，经喷雾干燥而成干浸膏粉。该浸膏粉外观性状为黄棕色，味微苦、涩，每克浸膏粉相当于18.2 g生药。该浸膏粉含总黄酮1.8%，山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖甙0.2%, 槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖甙0.18%，由上海市中药研究所制备和提供，批号020708。实验前，用蒸馏水配制成所需浓度的药液备用。氟尿嘧啶针剂， 250 mg/10 mL，内容物为微黄色透明液体，上海旭东海普药业有限公司产品，批号990632。使用时，用生理盐水稀释至10 mg/mL浓度备用。人参提取物：外观性状为淡黄色干浸膏粉，富含人参皂甙。使用时，用蒸馏水稀释至800 mg/100 mL浓度的药液备用。云芝糖肽胶囊：上海新康制药厂产品，批号020707，实验时，用蒸馏水稀释至 0.08 g/mL浓度的药液，备用。

1.3 肿瘤细胞株

小鼠 C26 肠癌和 L929 细胞株，由上海医药工业研究院药理室提供。

1.4 仪器、试剂

8453紫外可见分光光度计(美国Agilent公司);310型CO2培养箱(美国Thermo 公司); 5804R冷冻离心机(德国Eppendorf公司); 2-16K离心机(德国Sigma公司)。

1.5 试验方法

1.5.1 碳粒廓清试验 小鼠48只，按体质量随机分成4组，每组12只。受试物给药组小鼠分别灌胃给柘木提取物0.3 g/kg、0.8 g/kg，阳性药对照组灌胃给人参提取物0.16 g/kg，空白对照组灌胃给等容量蒸馏水。每日给药1次，连续7d。给药容量均为20 mL/kg。末次给药后1 h, 分别在各小鼠尾静脉处注入印度墨水0.1 mL/只, 于注射后l min及10 min, 先后自小鼠眼眶后静脉丛取血20 μL，溶于2 mL 质量分数0.1%Na2CO3溶液中混匀，用紫外分光光度计，在680 nm波长处比色，读取吸光度值(A)，并按以下公式计算吞噬指数X值和吞噬活性α值。

K=(LogA1-LogA10)÷(t10-t1)

α=K1/3×体质量÷(肝重+脾重)

其中A1和A10分别为注射印度墨水1 min和10 min时所取血样的A, t10-t1为两次取血样的时间差。1.5.2 巨噬细胞吞噬试验 小鼠60只，按体质量随机分成4组，每组12只。受试物给药组小鼠分别灌胃给柘木提取物0.3 g/kg、0.8 g/kg，阳性药对照组灌胃给人参提取物0.16 g/kg，空白对照组给等容量蒸馏水，每日1次，连续7d。给药容量均为20 mL/kg。末次给药后每鼠腹腔注射体积分数2%鸡红细胞0.5 mL，1 h后颈椎脱臼法处死，剪开腹腔皮肤，腹腔内注入2 mL生理盐水，轻揉小鼠腹部后，吸取腹腔冲洗液滴于载玻片上，于37 ℃温育30 min，孵毕，于生理盐水中漂去未被吞噬的鸡红细胞，吹干，1∶1丙酮-甲醇溶液固定5 min，4%Giemsa-Wright染色液染色3 min，晾干后于油镜下观察。计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬百分率=100个巨噬细胞中吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数÷100个巨噬细胞数×100% ;

吞噬指数=100个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的总数÷100个巨噬细胞数

1.5.3 淋巴细胞增殖试验 取 F1 小鼠，右足趾皮下接种无菌制备的 C26 肠癌混悬液 0.05 mL/鼠 (约1 × 106个肿瘤细胞)，次日随机分成7组，每组8只。受试物不同剂量给药组分别灌胃给柘木提取物0.3g/kg、0.6 g/kg、1.3 g/kg、2.6 g/kg、5.2 g/kg模型对照组灌胃给蒸馏水，阳性药对照组灌胃给云芝糖肽胶囊药液 2g/kg。每日 1 次，连续 10d给药容量均为 20 mL/kg。末次给药后次日在无菌条件下取小鼠脾脏，用 100 目筛网制成单个脾细胞悬液，用含 体积分数10% 灭活小牛血清的 RPM 1640 培养液调节细胞浓度为 1 × 107个细胞/毫升加入 96 孔细胞培养板，每孔 100 μL (1×106个细胞 /孔)，再加入含 ConA(5 μg/mL)培养液 100 μL置37 ℃体积分数5%CO2条件培养72 h。轻轻吸弃上清液100 μL，加入噻唑蓝(MTT)溶液(MTT 5 mg/mL)20 μL。放置 37 ℃ 体积分数 5% CO2条件培养2 h后加入消化液100 μL，再放置至次日测各孔A值。实验重复2次。刺激指数计算公式： 刺激指数 = 实验组A值/对照组 A 值

1.5.4 自然杀伤(NK) 细胞毒活性检测 取 F1 小鼠右足趾皮下接种无菌制备的 C26 肠癌混悬液0.05 mL鼠 (约 1 × 106个肿瘤细胞), 次日随机分成7组, 每组8只。受试物不同剂量给药组5组, 分别灌胃给柘木提取物 0.3 g/kg、0.6 g/kg、1.3 g/kg、2.6 g/kg 5.2 g/kg, 模型对照组灌胃给蒸馏水, 阳性药对照组灌胃给云芝糖肽胶囊药液 2 g/kg。每日1次，连续 10 d。给药容量均为 20 mL/kg。末次给药后次日在无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网制成单个脾细胞悬液, 低渗除去红细胞, 将细胞悬液转入培养瓶中, 37 ℃ 体积分数5% CO2条件培养 1 h后去除贴壁细胞，计数活细胞并调整细胞浓度为 3 × 10个细胞/毫升作为效应细胞。靶细胞取 L929 体外培养细胞，常规培养 24 h，以培养液调整细胞浓度为 1.5 × 105个细胞/mL，使效靶细胞之比为20∶1。取 96 孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞, 另设效应细胞和靶细胞对照, 于 37 ℃体积分数5% CO2条件培养 4 h后，加入 MTT 染色液，再培养 2 h后加入消化液，于次日测各孔A 值。实验重复2次。NK 细胞毒活性计算公式：

NK细胞毒活性(%)=[1-(实验组A平均值-效应细胞A平均值)/ 靶细胞对照组A平均值]×100%

1.5.5 数据统计 采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计。计量资料采用± s表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐性时用LSD及SNK方法分析，方差不齐时用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 碳粒廓清试验

柘木提取物使小鼠吞噬指数K值和校正吞噬活性α值均有升高，与空白对照组比较差异显著(P＜0.05)(表 1)。

表 1 柘木提取物对正常小鼠碳粒廓清能力的影响Table 1 Effects of ZHEMU extrac on the ink clearance abilities in normal mice

2.2 巨噬细胞吞噬试验

柘木提取物使小鼠对鸡红细胞的吞噬百分率或吞噬指数均有明显提高(P＜0.05或 P＜0.01)(表2)。

表 2 柘木提取物对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响Table 2 Effects of ZHEMU extrac on the phagocytosis of peritoneal macrophages in normal mice

2.3 淋巴细胞增殖试验

柘木提取物对C26荷瘤小鼠的淋巴细胞转化活性均有非常显著的提高作用(P＜0.01)。受试物各剂量(由低剂量至高剂量)淋巴细胞转化活性刺激指数分别为 1.37、1.45、1.38、1.35、1.39(表 3)。

2.4 NK 细胞毒活性检测

柘木提取物对C26荷瘤小鼠的NK细胞毒活性均有非常显著提高作用(P＜0.01)(表4)。

表 3 柘木提取物对C26荷瘤小鼠淋巴细胞增殖活性的影响Table 3 Effects of ZHEMU extrac on T Lymphocytes proliferative activity in C26 tumor bearing mice

表 4 柘木提取物对C26荷瘤小鼠NK细胞毒活性的影响Table 4 Effects of ZHEMU extrac on the cytotoxicity of NK cell in C26 tumor bearing mice

3 讨论

柘木提取物(水煎剂)治疗胃肠道肿瘤始于民间，以柘木提取物作为药用原料进行抗癌药物开发始于1960年代。经上海中药制药二厂、上海市第九制药厂、上海市医药工业研究院、河南医学学科研究所、上海市中药研究所以及上海雷允上药业有限公司的历代科研人员的不懈努力，柘木糖浆[4]产品于1977年被批准上市，柘木注射剂在1980年研发成功，柘木颗粒[5]于2008年获得生产批件。

40多年来，以柘木提取物作为药用原料的制剂在临床上得到广泛应用[9,10]。临床结果显示，柘木制剂对胃肠道肿瘤具有明显抑制疗效。前期主要药效学研究结果亦显示，柘木提取物体外对SGC-7901胃癌细胞和HCT-116肠癌细胞生长有直接抑制活性，灌胃给药对裸小鼠SGC-7901移植瘤和F1小鼠C26肠癌足趾重量有明显减轻效果[6]。药效和临床结果均显示，柘木提取物对消化道肿瘤具有明显抑制作用。

柘木提取物对胃肠道肿瘤患者化疗或放疗呈现良好辅助治疗作用已成为其临床应用的一大特点，表现为能改善患者临床征候，保护细胞免疫功能，改善病人生活质量，且未见明显不良反应[7]。对此，本文就柘木提取物对机体免疫调节作用进行了探索，结果表明其能显著提高正常小鼠碳粒廓清能力和腹腔巨噬细胞吞噬功能，明显增强对荷瘤小鼠淋巴细胞转化和NK细胞毒的活性。该结果提示，柘木提取物对胃肠道肿瘤的抑制作用与其通过免疫系统直接或间接增强机体抗肿瘤效应有关。关于柘木提取物对正常和荷瘤动物的淋巴细胞转化试验及各种细胞因子测定等有待进一步研究。

据成分分析，本受试物柘木提取物中富含黄酮和多糖类化合物。有研究认为，柘木中的黄酮类化合物是抗癌、抑癌的有效成分[10-14]，多糖类化合物参与了机体的免疫调节[15,16]，两者对胃肠道肿瘤具有协同对抗作用。柘木提取物抑制胃肠道肿瘤的多靶点效应，其所富含的黄酮和多糖类化合物可能就是其药效活性物质基础。

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Immunologic Mechanism of Inhibition on Gastrointestinal Tract Tumors of ZHEMU Extract

XIE Jia-jun1, ZHANG Guo-ming2,3, QIAO Zheng-dong4, LU Hong-qi5, YAN Hui-fang5, CHENG Mao2,3
(1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;2. Shanghai Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai 201400, China;3. Shanghai Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd,Shanghai 201400, China;
4. Shanghai Pudong Hospital, Shanghai 201399, China;5. Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China)

Objective To observation the changes of immune function in normal or tumor bearing animal after dose ZHEMU extract. Methods The carbon particle clearance test, macrophage phagocytosis test. NK cells activity and lymphocyte transformation in tumor bear animal are detected. Results The carbon granula clearance ability and phagocytosis of macrophage cell in abdominal on normal mice, and the lymphocyte transformation and natural killer (NK) cell activity in tumor bearing mice were enhanced after dosing, and the lowest effective dose were 0.3 g/kg, equivalent to the crude herb 5.46 g/kg, which was 1.3 times of clinical daily dose. Conclusions ZHEMU extract can restrain the growth of gastrointestinal tract tumors, and its mechanism may be related to the direct inhibition of the gastrointestinal tract cancerous cells growth and the improvement of the body's specific and non-specific immune function.

ZHEMU extract; Gastrointestinal tract tumors; Anti-tumor activity; Immune function

Q95-33

A

1674-5817(2017)04-0278-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.04.004

2017-02-06

谢家骏(1959-), 男, 研究员, 研究方向： 主要从事中药药理毒理学研究与中药新药开发研究。E-mail： xiejj001@163.com