卵泡刺激素对多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞分泌抗苗勒管激素的影响

胡月莲

(佛山市中医院禅城高新区医院妇产科，广东 佛山 528000)

卵泡刺激素对多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞分泌抗苗勒管激素的影响

胡月莲

(佛山市中医院禅城高新区医院妇产科，广东 佛山 528000)

目的 探讨卵泡刺激素(FSH)对多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞分泌抗苗勒管激素(AMH)的影响。方法 将60例PCOS患者按随机数字表法分为A组和B组，每组30例。2组在月经结束后的1周内经阴道穿刺取窦卵泡，在窦卵泡中将颗粒细胞分离出来。A组的颗粒细胞给予FSH刺激，B组的颗粒细胞不给予FSH刺激。分别检测2组血清AMH水平、AMH mRNA表达水平及颗粒细胞中AMH启动子的活性。结果 A组血清AMH水平、AMH mRNA表达水平及颗粒细胞中AMH启动子活性均明显高于B组(均P<0.05)。结论AMH是准确评估PCOS患者卵巢储备功能的指标之一，而FSH用于PCOS能够抑制患者卵巢颗粒细胞AMH的过度分泌，有效促进卵泡正常发育。

多囊卵巢综合征； 卵泡刺激素； 颗粒细胞，卵巢； 抗苗勒管激素

多囊卵巢综合征(PCOS)是生育年龄妇女常见的一种复杂的内分泌及代谢异常所致的疾病，以排卵功能损失或丧失及男性激素产生过剩为主要特征，临床表现为闭经、多毛、肥胖和不孕[1]。抗苗勒管激素(AMH)又称苗勒管抑制物质，是转化生长因子B超家族成员之一。在女性，AMH是由生长卵泡的颗粒细胞分泌，在绝经前一直维持可检测的水平，也具有调节生殖细胞发育和分化的功能[2-3]。近年来，AMH与卵巢功能、PCOS及辅助生殖的关系一直是国内外学者关注的热点问题。本研究探讨卵泡刺激素(FSH)对PCOS患者卵巢颗粒细胞分泌AMH的影响，从而明确AMH的临床意义及FSH对PCOS的治疗效果。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2015年7月至2016年11月在佛山市中医院禅城高新区医院门诊接受治疗的PCOS患者60例，均符合PCOS诊断标准[4]。排除由库欣综合征、先天性肾上腺皮质增生、雄激素分泌性肿瘤、外源性雄激素应用、21-羟化酶缺乏性非典型肾上腺皮质增生等导致的高雄激素血症的患者。

将60例患者按随机数字表法分为2组：A组30例，年龄(28.3±2.7)岁，体质指数(22.1±3.1)kg·m-2，AMH(8±4)μg·L-1，卵泡刺激素(5.4±1.7)U·L-1，促黄体生成素(12±3)U·L-1，催乳素(0.6±0.4)nmol·L-1，雌二醇(136±54)pmol·L-1，睾酮(3.1±0.6)nmol·L-1。B组30例，年龄(27.4±2.1)岁，体质指数(23.4±2.8)kg·m-2，AMH(9±3)μg·L-1，卵泡刺激素(5.1±1.6)U·L-1，促黄体生成素(13±4)U·L-1，催乳素(0.7±0.4)nmol·L-1，雌二醇(138±51)pmol·L-1，睾酮(3.0±0.7)nmol·L-1。

2组年龄、体质指数及AMH、卵泡刺激素、促黄体生成素、催乳素、雌二醇、睾酮水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 颗粒细胞培养

2组在月经结束后的1周内经阴道穿刺取窦卵泡，在窦卵泡中将颗粒细胞分离出来：1)取卵时获取卵泡液，2000 r·min-1离心10 min，去上清液；2)用磷酸盐缓冲液(PBS)将沉淀配成悬液，将细胞沉淀悬液以1:1的比例加入淋巴细胞分离液中，2000 r·min-1离心30 min，可见界面处有明显的颗粒细胞层；3)将颗粒细胞吸取出并置于一新的离心管中，用PBS冲洗2次。1500 r·min-1离心10 min，去上清液，将淋巴细胞分离液洗涤并去除；4)加5 mL PBS洗涤，2000 r·min-1离心5 min，去上清液和剩余的红细胞；5)加5 mL PBS洗涤，2000 r·min-1离心5 min，去红细胞裂解液，调整细胞密度；6)在颗粒细胞中加入M199细胞液(上海经科化学科技有限公司)，放置37 ℃、5%CO2培养箱(日本SANYO公司，型号：MCO-18AIC)中培养2～3 d。

1.2.2 FSH刺激方法

A组的颗粒细胞给予FSH刺激，其方法为：在月经周期第2天开始注射人基因重组促卵泡激素(r-FSH，Gonal-F75IU/支)，根据阴道B超监测卵泡直径对Gn剂量进行调整，直至2～3个卵泡直径达到16～18 mm。B组的颗粒细胞未给予FSH刺激。

1.2.3 各指标检测方法

1) 标本采集。2组在自然月经周期第3天空腹抽取肘静脉血3 mL，3000 r·min-1离心5 min，取血清，置-20 ℃ 冰箱保存，待测。

2)检测方法。①采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测2组血清AMH的水平，ELISA试剂盒购自美国DSL公司，具体操作根据试剂盒说明书进行。②使用美国Applied Biosystem公司生产的7500型荧光定量基因扩增仪及trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)检测AMH mRNA表达的水平，具体操作根据试剂盒说明书及根据仪器标准化操作程序进行。AMH mRNA表达水平的计算采用2-△△Ct法。③采用PCR技术提取基因组DNA(DNA大小为3078 bp)，克隆PCR扩增产物至1pMD19-T质粒(日本TaKaRa公司)中，并将其克隆至携带有萤火虫荧光酶的PGL3载体(美国Promega公司)中。以PGL3-CON质粒作为阳性对照，PGL3空白质粒作为阴性对照，检测扩增的克隆基因中是否含有启动子的序列。然后，体外培养颗粒细胞1 d。贴壁后，通过脂质体lipofectamin2000(美国Invitrogen公司)将携带海肾荧光素酶的PRL-TK质粒(美国Promega公司)和AMH荧光报告载体转染至颗粒细胞中。48 h后，收集颗粒细胞，并采用双荧光素酶报告系统(美国Promega公司)检测并计算AMH启动子的活性。

1.3 统计学方法

2 结果

A组血清AMH水平、AMH mRNA表达水平及颗粒细胞中AMH启动子活性均明显高于B组(均P<0.05)，见表1。

组别nAMHρ/(μg·L-1)AMHmRNA颗粒细胞中AMH启动子活性A组3012.48±2.973.09±1.0712.03±2.15B组307.59±0.881.89±0.617.69±2.57t18.9314.81612.631P<0.05<0.05<0.05

3 讨论

PCOS是由生殖内分泌和代谢功能异常致排卵障碍性疾病，其发病率在育龄妇女中高达10%左右[5]。目前，PCOS的病因尚不清楚，其发病机制及诊疗方法的研究一直以来都备受学界的关注。AMH是由卵巢窦卵泡的卵巢颗粒细胞分泌的活性因子，其具有调控卵巢生长、发育和成熟以及预测卵巢储备功能的作用，尤其在卵巢储备功能的评价方面，其可单独应用或与其他指标联合应用，从而有效指导体外受精的治疗[6]。AMH也是PCOS诊断的重要指标之一，可反映疾病的严重程度。在PCOS患者中，AMH水平升高，患者初级卵泡的生长和分化受到抑制，从而出现排卵；AMH对外周芳香酶活性具有抑制作用，进而导致血液中雄激素水平升高[7]。

本研究通过检测卵巢颗粒细胞给予FSH刺激(A组)和卵巢颗粒细胞未给予FSH刺激(B组)的血清AMH水平、AMH mRNA表达水平以及颗粒细胞中AMH启动子的活性，结果发现，A组血清AMH水平、AMH mRNA表达水平均明显高于B组(均P<0.05)，提示FSH刺激可抑制PCOS患者卵巢颗粒细胞表达和分泌AMH。本研究结果还发现，A组颗粒细胞中AMH启动子活性明显高于B组(P<0.05)，分析其原因可能是FSH通过对AMH启动子调控元件产生作用，从而对AMH mRNA的表达具有抑制作用[8-9]。

综上所述，AMH是准确评估PCOS患者卵巢储备功能的指标之一，而FSH用于PCOS能够抑制患者卵巢颗粒细胞AMH的过度分泌，从而有效促进卵泡正常发育，有可能成为一种新的治疗PCOS的方法。

[1] 卢永军，阮祥燕，田玄玄，等.多囊卵巢综合征综合治疗对妊娠结局的影响[J].首都医科大学学报，2014，35(4)：428-432.

[2] El Mazny A，Abou Salem N.Anti-Müllerian hormone and antral follicle count for prediction of ovarian stimulation response in polycystic ovary syndrome[J].Gynecol Endocrinol，2013，29(9)：826-829.

[3] Sahmay S，Atakul N，Oncul M，et al.Serum anti-Mullerian hormone levels in the main phenotypes of polycystic ovary syndrome[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013，170(1)：157-161.

[4] Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome[J].Fertil Steril，2004，81(1)：19-25.

[5] 张婧，李荔，陈文芬，等.多囊卵巢综合征发病机制研究进展[J].实用医学杂志，2014，30(2)：323-325.

[6] Lin W Q，Yao L N，Zhang D X，et al.The predictive value of anti-Mullerian hormone on embryo quality，blastocyst development，and pregnancy rate following in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET)[J].J Assist Reprod Genet，2013，30(5)：649-655.

[7] 李轶，李瑞岐，欧颂邦，等.高雄激素和非高雄激素型多囊卵巢综合征患者血清抗苗勒管激素分泌特点及诊断效能比较[J].实用妇产科杂志，2014，30(2)：111-115.

[8] 陈晓，季银芬，徐键.抗苗勒氏管激素(AMH)与多囊卵巢综合征(PCOS)卵泡发育异常的关系[J].生殖与避孕，2014，34(5)：383-387.

[9] 徐鑫，李凌云，张静文，等.两种卵泡刺激素在多囊卵巢综合征患者体外受精-胚胎移植中疗效比较[J].生殖医学杂志，2016，25(4)：305-309.

(责任编辑：胡炜华)

Effect of Follicle Stimulating Hormone on Secretion of Anti-Mullerian Hormone by Granulosa Cells in Patients with Polycystic Ovary Syndrome

HU Yue-lian

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ChanchengHighTechDistrictHospitalofFoshanTraditionalChineseMedicineHospital,Foshan528000,China)

Objective To investigate the effect of follicle stimulating hormone(FSH) on the secretion of anti-Mullerian hormone(AMH) by granulosa cells in patients with polycystic ovary syndrome(PCOS).Methods Sixty patients with PCOS were randomly divided into group A and group B,with 30 patients in each group.Antral follicles were collected by transvaginal puncture within 1 week after the end of menstrual cycle.Granulosa cells were separated from antral follicles,and were stimulated with FSH(group A) or not(group B).Serum AMH level,AMH mRNA expression and AMH promoter activity were detected in both groups.Results Compared with group B,serum AMH level,AMH mRNA expression and AMH promoter activity significantly increased in group A(P<0.05).Conclusion AMH is one of the indicators of ovarian reserve function in patients with PCOS.FSH can inhibit the excessive secretion of AMH in ovarian granulosa cells and promote the normal development of follicles in the treatment of PCOS.

polycystic ovary syndrome; follicle stimulating hormone; granulosa cells,ovary; anti-Mullerian hormone

2017-01-19

佛山市卫生和计生局医学科研课题立项(20170166)

胡月莲(1980—)，女，本科，主治医师，主要从事妇科疾病的诊治研究。

R711； R458

A

1009-8194(2017)07-0045-03

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.07.018