干扰素α对乙型肝炎病毒感染小鼠血清病毒标记物的影响*

周 云，李 盛，唐宗生，杨东亮，宋景娇

·短篇论著·

干扰素α对乙型肝炎病毒感染小鼠血清病毒标记物的影响*

周 云，李 盛，唐宗生，杨东亮，宋景娇

目的 探讨干扰素-α（IFN-α）在高压尾静脉注射乙型肝炎病毒（HBV）感染小鼠血清HBV标记物的影响。方法 采用高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-α4表达质粒，建立HBV感染小鼠模型，采用ELISA法检测血清HBsAg、HBeAg、HBsAb和HBcAb。分离小鼠肝脏内淋巴细胞，使用流式细胞仪检测淋巴细胞FoxP3表达情况。结果 在高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒后第1 d，小鼠血清HBsAg和HBeAg开始出现阳性，而第20 d时HBsAg和HBeAg已消失；在注射pAAV/HBV 1.2+IFNα 后第 1 d，血清 HBeAg水平为（0.55±0.16），显著低于 pAAV/HBV 1.2 组【（1.40±0.13），P＜0.05）；在注射后第 10 d，血清 HBsAg水平为（0.35±0.20），显著低于 pAAV/HBV 1.2 组【(2.35±0.15），P＜0.05】；在高压尾静脉注射后 20 d，两组小鼠血清HBsAb阴性；在注射pAAV/HBV1.2后第10 d和20 d，两组小鼠血清HBcAb阳性水平差异无统计学意义（P＞0.05）；注射后，两组小鼠肝内CD4+T淋巴细胞FoxP3表达未见显著变化。结论 IFN-α具有抗HBV作用，并未诱导免疫负调控反应。

乙型肝炎；pCMV2/IFN-α4表达质粒；HBsAg；HBeAg；小鼠

全世界约有20亿人感染过HBV，其中3.5亿为慢性HBV携带者，每年死于肝炎、肝硬化和肝癌患者约60万[1]。干扰素α（Interferon-alpha，IFN-α）是目前治疗慢性乙型肝炎的主要药物之一，具有广谱抗病毒和免疫调节作用，抑制病毒复制，促进人类白细胞抗原表达，增强NK和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性[2，3]。我们在高压尾静脉注射HBV感染小鼠探讨了IFN-α的抗病毒和免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 SPF级BALB/c雌性小鼠，8周龄，购自湖北省疾病控制中心，饲养于我院实验动物中心。所有动物实验均符合本校动物实验伦理委员会的规定。pAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-α4分别由台湾大学陈培哲教授和德国伊斯堡-埃森大学病毒研究所陆蒙吉教授惠赠。检测HBV标记物的ELISA试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司；Endo-free Plasmid Maxi Kit购自美国OMEGA公司；APC标记的抗鼠CD4、PE标记的抗小鼠/大鼠FoxP3抗体和FoxP3穿孔/固定浓缩稀释液购自美国ebioscience公司。胶原酶II和Percoll淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司。

1.2 HBV感染小鼠模型的建立 将pAAV/HBV1.2 10μg或pCMV2/IFN-α4质粒20μg单独或共同溶解于相当于小鼠体质量10%的生理盐水，混匀后转移至注射器，自小鼠尾静脉末端1/3处迅速注入。注射后第1 d、10 d、20 d采血，分离血清，标本冻存于-80℃冰箱。

1.3 血清HBV标记物的检测 将小鼠血清与1×PBS按照1:10比例稀释，混匀后加入96孔板，每孔加稀释血清50 μl，再加50μl相应的酶结合物，轻轻混匀，37℃孵育1 h，洗板，加显色剂，37℃孵育30 min，终止显色，酶标仪读取450 nm吸光度。

1.4 小鼠肝脏内淋巴细胞分离 给予小鼠1%戊巴比妥200 μl腹腔注射，麻醉成功后，摘除眼球，取血约800μl，断颈处死小鼠后，置于75%酒精中浸泡3 min，仰卧固定，切开皮肤和腹膜，充分暴露肝脏。通过门静脉缓慢注射少量PBS后使肝脏颜色变为灰白色，剪断下腔静脉，取PBS 10 m l，缓慢灌洗肝脏，直至灌洗液中无血细胞流出。取小鼠肝脏于虑筛研磨肝脏，加入RPMI 1640培养基洗脱，加胶原酶II溶液于沉淀中，37℃温箱中放置40 min，期间振荡数次。然后，加冷DPBS，离心，重悬细胞沉淀于淋巴细胞分离液，离心，弃上清，用RPMI 1640培养基600μl重悬淋巴细胞，计数。

1.5 肝脏内CD4+T淋巴细胞FoxP3表达 取淋巴细胞，接种于 96 孔板，加抗 CD4-APC（1：100）50 μl，4℃避光 30 min。将dilution液与buffer液按照1：3混合，每孔100 μl，4℃孵育2 h，每孔再加100μl 1×buffer，洗涤。每孔加抗FoxP3（1:100）50 μl，4℃放置30 min。洗涤，PBS重悬，上流式细胞仪检测。

1.6 统计分析 应用GraphPad Prism软件作图和SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组间均数的比较采用两独立样本的t检验，P＜0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组动物血清HBeAg和HBsAg水平变化 在高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒后第1 d，小鼠血清HBsAg和HBeAg开始出现阳性，而第20 d时HBsAg和HBeAg已消失。在注射pAAV/HBV 1.2+IFNα后第1 d，血清HBeAg水平为（0.55±0.16），显著低于pAAV/HBV 1.2组【（1.40±0.13），P＜0.05，图 1）；在注射 pAAV/HBV 1.2+IFNα 后第 10 d，血清 HBsAg水平为（0.35±0.20），显著低于 pAAV/HBV 1.2 组【（2.35±0.15），P＜0.05，图 2）。

图1 两组小鼠血清HBeAg水平比较

图2 两组小鼠血清HBsAg水平比较

2.2 两组动物血清HBsAb和HBcAb水平变化 在高压尾静脉注射后20 d，两组小鼠血清HBsAb阴性（图3）；在注射pAAV/HBV1.2后第10 d和20 d，竞争ELISA法检测小鼠血清HBcAb呈阳性，而注射pAAV/HBV 1.2+IFNα小鼠血清HBcAb水平下降，但差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

2.3 两组动物肝内Treg变化 两组小鼠肝内CD4+T淋巴细胞FoxP3表达未见显著变化（图5）。

图3 两组小鼠血清HBsAb水平变化

图4 两组小鼠血清HBcAb水平变化

图5 两组小鼠肝内CD4+T淋巴细胞FoxP3表达比较A：pAAV/HBV 1.2组；B：pAAV/HBV 1.2+IFNα 组

3 讨论

尽管发现Ⅰ型IFN近60年了，它具有抗病毒作用和免疫调节作用，但是其作用机制尚不完全清楚[4]。IFNα是一个多能细胞因子，主要由单核细胞和B细胞经病毒诱导产生，与IFNAR结合，激活Jak/STAT信号通路，导致大量ISGs转录，表达多种抗病毒蛋白[5]。目前，临床上所用的IFNα仅仅对部分乙型肝炎患者有效，说明IFNα可能具有极其复杂的抗病毒作用和免疫激活或免疫抑制功能[6]。

在高压尾静脉注射小鼠，IFN-α能抑制HBV复制，显著抑制HBsAg和HBeAg表达，促进病毒的清除。IFNα与其受体结合，引发细胞膜上信号传导，诱导抗病毒蛋白如OAS、MxA和PKR等表达，抑制肝细胞内病毒复制，促进病毒的清除。在HBV转基因小鼠中，可能因免疫耐受等原因，IFNα对血清HBsAg水平无影响，但是，IFNα能显著提高小鼠外周血CD4+T细胞和CD19+B细胞数量，发挥免疫调节作用[7]。

最近研究发现，Ⅰ型IFN具有免疫抑制作用[8-11]。在LCMV系统，持续性IFN信号驱动表达DC和巨噬细胞表达免疫抑制因子PDL1和IL10，而敲除IFNAR能暂时性升高病毒滴度，但最终的结果是促进病毒清除[12,13]。LCMV诱导产生的IFN活化STAT2而非STAT1，从而抑制DC增殖发育[14]。在结核菌持续感染小鼠，IFN诱导DC和巨噬细胞产生IL-10，抑制结核菌特异性免疫反应[15]。IFNα在HIV患者可诱导CD4+T细胞和记忆B细胞凋亡[16]。I型干扰素抑制病毒特异性CD4+Th1细胞免疫反应[17]。目前，IFNα治疗慢性乙型肝炎的持续应答率不足40%。那么，IFNα是否诱导了免疫负调控的产生呢？

IFN-α在高压尾静脉注射小鼠未诱导免疫负调控。肝脏是一个免疫耐受器官[18]。我们不仅分离脾脏淋巴细胞，同时分离了肝脏内淋巴细胞。经流式细胞仪分析发现，肝脏内免疫负调控分子PD1和FoxP3表达没有任何变化，这可能与我们使用的急性HBV感染小鼠模型有关。在体液免疫方面，IFN-α处理与否，两种小鼠均未检测到HBsAb产生，在该模型中HBsAb可能在病毒早期清除过程中未发挥作用，而HBcAb产生较早，高压尾静脉注射小鼠第4天就开始产生（数据未列出），这是因为HBcAg可以直接刺激B细胞产生抗体，无需抗原递呈细胞[19]。IFN-α处理组HBcAb产生水平稍低，一方面原因是IFN-α可能抑制了HBcAg表达，从而导致抗体的减少；另一方面，IFN-α可能抑制了体液免疫应答。

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（收稿：2016-11-20）

（本文编辑：陈宗炳）

Serum HBsAg and HBeAg changes in pCMV 2/IFN-α4 p lasm id-in fected m ice

Z hou Yun，Li Sheng，Tang Zongsheng，et al.Department of Infectious Diseases，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Hepatitis B；pCMV2/IFN-α4 plasmid；HBsAg；HBeAg；Mice

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.04.026

国家传染病防治科技重大专项项目（编号：2008ZX10002-011）

430022武汉市 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染性疾病科（周云，李盛，唐宗生，杨东亮）；附属同济医院实验医学中心（宋景娇）；河南大学医学院（周云）

周云，男，36岁，医学博士。主要从事感染与免疫研究。E-mail:zyky120@126.com

宋景娇，E-mail:jjsong@tjh.timu.edu.cn