白藜芦醇对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织SIRT3表达的影响*

陈 娟，孔维宗，梁 凯，王迎春

·实验性肝炎·

白藜芦醇对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织SIRT3表达的影响*

陈 娟，孔维宗，梁 凯，王迎春

目的 研究非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝组织沉默交配型信息调节因子2同源蛋白3（SIRT3）的表达变化，探讨其在NASH发病中的作用及白藜芦醇对其的影响。方法 60只SD大鼠被随机分为正常对照组、NASH模型组和白藜芦醇处理组，每组20只。采用高脂饲料喂养建立NASH大鼠模型。制备新鲜肝组织匀浆，检测肝组织内活性氧（ROS）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。常规检查肝组织病理学变化和超微结构的变化。采用免疫组化法分析SIRT3蛋白的亚细胞定位，采用Western Blot定量检测SIRT3蛋白的表达。结果 模型组大鼠肝指数、血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C含量和氧化应激水平显著高于对照组（P＜0.01），药物处理组显著低于模型组（P＜0.01）；模型组大鼠非酒精性脂肪性肝病活动性评分（NAS）为（6.83±0.41）分，显著高于对照组[（0.24±0.08）分，P＜0.01]，处理组为（3.27±0.29）分，显著低于模型组（P＜0.01）；模型组大鼠肝细胞线粒体半定量评分为（3.24±0.21）分，显著高于对照组[（0.17±0.03）分，P＜0.01]，处理组为（1.39±0.12）分，显著低于模型组（P＜0.01）；免疫组化检测显示SIRT3蛋白在细胞核和细胞质中均有表达，模型组SIRT3蛋白相对表达量为（0.24±0.03），显著低于对照组[（0.58±0.02），P＜0.01]，而处理组为（0.46±0.03），显著高于模型组（P＜0.01）。结论 NASH 大鼠肝组织 SIRT3 表达量下降，白藜芦醇干预可通过上调SIRT3的表达改善NASH病理学变化。

非酒精性脂肪性肝炎；SIRT3；白藜芦醇；大鼠

随着肥胖症和2型糖尿病在全球范围内流行，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率亦逐年攀升。有数据显示我国NAFLD患者总数已超过1亿[1]。NAFLD的疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝（nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）、 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、相关的肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[2，3]。以往的研究表明在诊断为肝硬化和隐源性肝硬化的患者中，50%有NASH背景[4]。沉默交配型信息调节因子2同源蛋白3（silent mating type information regulation 2 homolog 3，SIRT3）是定位于线粒体的一种Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，是第一个被定位于哺乳动物细胞线粒体的乙酰化酶（sirtuins），并且是唯一个被证明与人类寿命长度相关的蛋白[5]，是线粒体内主要的蛋白去乙酰化酶，对氧化代谢、氧化应激、细胞凋亡等多种生物活动具有调节作用[6-9]。有研究表明，SIRT3与多种肝脏疾病相关，是NAFLD疾病过程的一个重要的调控者[10]。白藜芦醇是SIRT3的激动剂，可使其表达上调，从而影响脂肪代谢[11]。本研究旨在探讨白藜芦醇对NASH大鼠肝组织SIRT3表达的影响及其对NASH的作用，以及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 雄性SPF级SD大鼠60只，体质量160～200 g，购自大连医科大学实验动物中心；白藜芦醇购自广州齐云生物技术公司；水合氯醛由大连美仑生物技术有限公司提供；检测ALT、AST、TG、TC、LDL-C试剂盒（南京建成生物工程研究所）；检测铜 /锌 /锰超氧化物歧化酶（Cu/Zn/Mn-superoxide dismutase，CuZn/Mn-SOD）活性试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物-碱性磷酸酶（strept avidin-biotinenzyme complex-alkaline phosphatase，SABC-AP）免疫组化染色试剂盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗SIRT 3多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；Vitros5.1FS自动生化分析仪（美国强生公司）；XD-202生物显微镜（南京江南永新光学有限公司）；IS4000MM小动物活体成像仪【美国Carestream 公司（原Kodak）】。

1.2 NASH大鼠模型的建立 取大鼠60只，适应性喂养1 w。随机分为对照组、NASH模型组和白藜芦醇处理组，每组20只。对照组以普通饲料喂养，其余两组均以高脂饲料喂养。12 w末，每组随机处死2只大鼠，验证成模情况。第13 w开始，白藜芦醇处理组动物每日给予6 mg/ml的白藜芦醇溶液灌胃，剂量为0.75 ml/100 g；模型组和对照组以0.75 ml/100 g的蒸馏水灌胃。于24 w末，禁食不禁水，次日称体质量后，以10%水合氯醛溶液0.3 m l/100 g腹腔内注射麻醉，固定大鼠，打开腹腔，用真空采血管自下腔静脉采血，迅速游离并取出肝脏，用预冷生理盐水冲尽血迹后，称量肝脏湿质量，以计算肝指数（肝指数=肝质量/体质量×100%）。取部分肝组织分别以中性甲醛和戊二醛固定，另取部分肝组织冰浴，用于制备新鲜肝组织匀浆，其余肝组织用液氮快速冷冻后，置于-80℃冰箱保存，以备后续实验。

1.3 血生化指标的检测 使用Vitros5.1FS自动生化分析仪检测。

1.4 肝组织氧化应激指标的检测 取少量新鲜肝组织，加入20倍体积的PBS缓冲液冰浴中充分研磨，离心，取上清，BCA法行蛋白定量。按ROS测试试剂盒说明书操作，测定各样本ROS含量，结果以荧光强度/mg protein表示；取少量新鲜肝组织，加入10倍体积的PBS缓冲液冰浴中充分匀浆，离心，取上清，蛋白定量后，按Cu/Zn/Mn-SOD活性检测试剂盒（WST-8法）说明书操作，检测各样本SOD活性，结果以U/mg protein表示。

1.5 肝组织病理学检查 取中性甲醛固定的肝组织，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光学显微镜下观察。参照Brunt[12]标准进行非酒精性脂肪性肝病活动性评分（nonalcoholic fatty liver disease activityscore，NAS）评分。

1.6 肝组织SIRT3亚细胞定位检测 采用免疫组化法检测，取中性甲醛固定的肝组织，石蜡包埋，常规切片后，按SABC-AP免疫组化染色试剂盒说明书操作，第一抗体为兔抗SIRT 3多克隆抗体（1:50）。在400倍显微镜下，在保持暴光条件、暴光时间和光圈恒定的条件下进行照片采集，图片用IPP6.0软件进行分析，测定每个视野中阳性反应积分吸光度值（A）及该视野的总面积（M），A/M所得的单位面积积分吸光度值即反映SIRT3蛋白表达量。

1.7 肝组织线粒体结构变化检查 取戊二醛固定的肝组织，PBS漂洗2次×15 min，1%锇酸固定2 h，PBS漂洗3次×15 min，梯度序列（50%、70%、80%、90%、100%）乙醇脱水，纯环氧树脂包埋、切片，枸橼酸铅、醋酸双氧铀染色各10 min，透射电镜下观察。每组大鼠随机选取3份肝组织样本，于相同放大倍数下随机选5个视野、拍照，每个视野随机观察10个肝细胞线粒体。参照Flameng[13]分级法进行肝细胞线粒体半定量评分：0级（0分）：线粒体结构正常，基质充满颗粒；Ⅰ级（1分）：结构基本正常，部分颗粒丧失（轻度肿胀，基质密度减少，嵴分离）；Ⅱ级（2分）：线粒体肿胀（基质密度明显降低，嵴分离）；基质澄清，嵴尚未断裂；Ⅲ级（3分）：线粒体嵴断裂，基质凝聚（严重肿胀）；Ⅳ级（4分）：内外膜完整性破坏，呈空泡状（严重肿胀伴嵴断裂，内外膜破裂）。每个样本线粒体的平均得分即为该样本的得分。

1.8 肝组织SIRT3表达检测 采用Western Blot法，提取肝组织总蛋白，取少量行蛋白定量，取样品，加上样缓冲液，煮沸 5 min；取蛋白 10μl，行SDS-PAGE电泳；转膜（湿转，350 mA，1h），5%脱脂牛奶封闭液封闭；第一抗体工作液（抗SIRT3抗体1:300，抗Actin抗体1:1000），4℃湿盒孵育过夜；换液漂洗，第二抗体工作液（1:1000）室温孵育1h，换液漂洗后，ECL显色液显色，使用IS4000MM小动物活体成像仪曝光、拍照，应用Quantity One v4.62软件分析每个条带的灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.9 统计学处理 应用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，各组数据间及两两比较行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组NASH大鼠肝指数及血清生化指标变化 模型组大鼠肝指数和血清生化指标较对照组显著升高，白藜芦醇处理组则较模型组明显下降（P＜0.01，表1），提示白藜芦醇可明显改善NAFLD大鼠肝功能及脂质代谢。

表1 各组大鼠肝指数和血清生化指标（±s）比较

表1 各组大鼠肝指数和血清生化指标（±s）比较

与对照组比，①P＜0.01；与模型组比，②P＜0.01

只肝指数（%）ALT（U/L）AST（U/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）对照组 18 2.5±0.3 46.8±4.3 85.8±7.3 0.3±0.1 0.92±0.2 0.52±0.1模型组 18 3.8±0.4① 85.3±6.7 127.5±9.4 0.8±0.2① 1.51±0.3① 1.72±0.4治疗组 18 3.0±0.3② 57.4±4.7② 94.6±8.5② 0.4±0.1② 1.17±0.3② 0.68±0.1

2.2 各组肝组织氧化应激指标的变化 3组大鼠肝组织ROS含量不同，差异有统计学意义（F=548.72，P＜0.01）。模型组肝组织 ROS含量为（407.19±13.68）荧光强度/mg protein，显著高于对照组[（265.36±9.73）荧光强度 /mg protein，P＜0.01]，白藜芦醇处理组为（323.62±15.41）荧光强度/mg protein，较模型组降低（P＜0.01）；3组大鼠肝组织SOD的活性不同，差异有统计学意义（F=257.88，P＜0.01）。模型组肝组织SOD活性为（1.67±0.25）U/mg protein，显著低于对照组 [（3.47±0.20）U/mg

protein，P＜0.01]，白藜芦醇处理组为（2.54±0.21）U/mg protein，显著高于模型组（P＜0.01），提示模型组大鼠氧化应激水平明显升高，白藜芦醇处理组则显著降低。

2.3 各组大鼠肝组织病理学改变 在光镜下，对照组大鼠肝小叶结构清晰，未见脂肪变性及炎症细胞浸润；模型组大鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞内可见大量大小不等的脂肪空泡，部分细胞呈气球样变性，伴大量炎性细胞浸润，部分肝细胞碎片状坏死，少量桥接坏死，汇管区可见轻、中度炎症反应；药物处理组肝细胞脂肪变性、坏死及炎性反应程度均较模型组减轻（图1）。3组大鼠NAS积分不同，差异有统计学意义（F=2196.45，P＜0.01），模型组肝组织NAS积分为（6.83±0.41）分，显著高于对照组[（0.24±0.08）分，P＜0.01]，药物处理组为（3.27±0.29）分，较模型组降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 各组大鼠肝组织学变化（HE，100×)

2.4 肝组织SIRT3亚细胞定位变化 在光镜下，对照组SIRT3蛋白呈强阳性表达，为深棕色颗粒，数量较多；模型组肝组织SIRT3表达阳性细胞着色较浅，数量较少；白藜芦醇处理组SIRT3表达较模型组增多，阳性细胞染色加深。值得一提的是，在各组大鼠肝细胞的细胞核和细胞质中均有SIRT3蛋白表达，但对照组以细胞核表达为主，模型组则以细胞质表达为主，药物处理组则细胞核和细胞质表达均较多（图2），提示SIRT3是一种细胞核、细胞质均表达的蛋白质，并且在应激状态下可能存在SIRT3表达从细胞核迁移到细胞质的现象。平均积分吸光度半定量分析发现，3组大鼠SIRT3蛋白表达量不同，差异有统计学意义（F=41.69，P＜0.01），模型组为（19.54±2.53），显著低于对照组 [（30.21±3.68），P＜0.01]；药物处理组为（26.75±2.84），显著高于模型组（P＜0.01）。

图2 各组大鼠肝组织SIRT3蛋白表达（免疫组化，400×）

2.5 各组大鼠肝细胞线粒体结构改变 在电镜下，对照组大鼠肝细胞内线粒体含量丰富，椭圆形，板层嵴；模型组肝细胞线粒体数量减少，极度肿胀，大部分嵴断裂甚至消失；白藜芦醇处理组肝细胞内线粒体数量增多，肿胀明显减轻，嵴数量增多（图3）。3组大鼠肝细胞线粒体Flameng半定量评分结果不同，差异有统计学意义（F=281.66，P＜0.01）。模型组大鼠肝细胞线粒体得（3.24±0.21）分，显著高于对照组[（0.17±0.03）分，P＜0.01]，白藜芦醇处理组得

（1.39±0.12）分，显著低于模型组（P＜0.01），提示白藜芦醇能明显改善线粒体结构损伤。

2.6 各组大鼠肝组织SIRT3蛋白表达量的变化 3组大鼠肝组织SIRT3蛋白表达量不同（图4），差异有统计学意义（F=336.71，P＜0.01）。模型组大鼠肝组织SIRT3蛋白的相对表达量为（0.24±0.03），显著低于对照组 [（0.58±0.02），P＜0.01]，药物处理组为（0.46±0.03），显著高于模型组（P＜0.01）。

图3 各组大鼠肝细胞线粒体结构的变化（50000×）

图4 各组大鼠肝组织SIRT3蛋白表达变化（Western Blot）

3 讨论

脂质沉积，尤其是甘油三酯在肝细胞内大量蓄积奠定了NAFLD的发病基础。沉默信息调节子2（silent information regulator 2，Sir2）蛋白和它在其他原核和真核生物的同源物（sirtuin）均属Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。具有高度的NAD+依赖性，其核心区域具有高度保守的蛋白去乙酰化酶活性及ADP核糖基转移酶活性，可与多种蛋白相互作用，调控细胞代谢、应激、衰老、凋亡等过程[14]。哺乳动物sirtuin家族共有7个成员，即SIRT1～SIRT7。其中SIRT3是首个被定位于哺乳动物细胞线粒体的sirtuins，并且是唯一一个被证明与人类寿命长度相关的蛋白[5]。虽然SIRT4、SIRT5也为线粒体蛋白，但SIRT4只具有ADP核糖基转移酶活性，SIRT5仅与为数不多的线粒体蛋白去乙酰化和琥珀酰化有关，sirtuins基因敲除实验证明大部分线粒体蛋白的去乙酰化修饰受SIRT3调控[15]。

本研究结果显示，模型组大鼠肝指数、血清生化指标、氧化应激水平、NAS评分、线粒体损伤程度均较对照组增加,并且免疫组化和Western Blot检测SIRT3表达量明显下降，而白藜芦醇处理组反映肝脏功能状态的指标均得到改善，氧化应激水平、NAS评分及线粒体损伤均减轻，SIRT3的表达量上调。一方面说明SIRT3参与NAFLD的病理过程，另一方面说明白藜芦醇对NASH具有治疗作用，这种作用可能是通过其影响SIRT3的表达，从而减轻线粒体的损伤来实现的。

长链脂酰辅酶A脱氢酶（long-chain acyl-CoA dehydrogenase，LCAD）是脂肪酸β-氧化的关键酶，为脂肪酸氧化代谢的第一步。LCAD缺陷可引起脂肪酸氧化作用障碍，使脂肪酸蓄积，TG沉积，引起肝脏脂肪变性及胰岛素抵抗[16]。SIRT3可降低LCAD的乙酰化水平，从而增强其活性，敲除SIRT3基因的小鼠脂肪酸氧化水平降低，肝脏中TG、胆固醇酯的含量分别较正常小鼠增加38%和41%，而通过病毒转染的方式使野生型小鼠过表达SIRT3后，肝脏中的TG含量下降近50%[17]。并且有研究显示，SIRT3去乙酰化活化LCAD可提高脂肪酸氧化能力，减少TG和脂肪酸氧化中间产物的蓄积，使脂肪肝和肥胖状态得到改善[6]。另外，SIRT3还可以激活AMPK蛋白，减少肝细胞中的脂质积累[18]，提示SIRT3可通过多条途径调节肝脏脂肪储蓄量，决定NAFLD的“第一次打击”的轻重。

根据SIRT3蛋白片段的大小，可将其分为两种形式，即44 KD的全长形式和N端被切去142个氨基酸形成的28 KD的短链形式。Onyango et al认为短链形式的SIRT3主要位于线粒体中，而过度表达的全长形式则分布于细胞基质中[19]。Cooper则认为全长形式SIRT3定位于细胞核内，但在应激因素的影响下可由细胞核转移至线粒体中，并且认为全长形式的SIRT3蛋白的剪切过程在细胞核中进行，被切掉N末端的短链形式则移位至线粒体[20]。然而，Sundaresan et al研究结果显示在心肌细胞中全长形式的SIRT3在线粒体、细胞核、细胞基质中均有分布，而短链形式的SIRT3特异性地分布于线粒体。在面对应激时，细胞基质、线粒体、细胞核内的SIRT3表达均上调[21]。我们的研究结果显示与之相似，在肝细胞中，SIRT3在细胞质和细胞核中都有分布，并且可能存在在应激状态下自细胞核转移到细胞质中的现象。高脂饮食小鼠SIRT3蛋白表达量呈现先上调后下降的的情况[17]。

SIRT3作为机体代谢、应激等多种生理病理的调控点，其具体的调控机制已经在心血管疾病领域得到广泛的研究，但其在肝脏疾病的研究才刚刚开始。本研究证实SIRT3参与NAFLD的发病，白藜芦醇可能通过上调SIRT3的表达发挥改善NASH的作用。另外，本实验还证实SIRT3在肝细胞细胞核和细胞质中均有表达，并且在长期高脂饮食的条件下存在SIRT3表达向细胞质转移的现象，但是关于影响SIRT3定位的因素、具体机制及其对细胞将产生何种影响均有待进一步深入研究。

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（收稿：2016-10-26）

（本文编辑：陈从新）

Im proved expression of SIRT 3 in liver tissues by resveratrol in rats w ith nonalcoholic steatohepatitis

Chen Juan，Kong Weizong，Liang Kai，et al.Department of Gastroenterology，Zhongshan Hospital，Affiliated to Dalian University，Dalian 116001，Liaoning Province，China

Objective To study the expression and effect of silent mating type information regulation 2 homolog 3（SIRT3）in rats with nonalcoholic steatohepatitis（NASH）and evaluate the beneficial intervention of resveratrol on it.M ethods The 60 rats were random ly divided into three groups（20 in each），e.g.normal，NASH and resveratrol-intervened groups.At the end of 24th week，all the rats were sacrificed.Serum biochemical parameters and liver histological ultrastructural characteristics were observed.Reactive oxygen species（ROS）and superoxide dismutase （SOD） in the liver tissues were determined，and SIRT3 protein was assayed by immunohistochemical staining and Western blot.Results The liver index，serum ALT，AST，TG，TC，LDL-C and oxidative stress levels in model rats were significantly higher than those in the normal control（P<0.01），and all those indicators in resveratrol-intervened group showed significantly lower than in the model group（P<0.01）；the nonalcoholic fatty liver disease activity score（NAS）in model group was（6.83±0.41），significantly higher than that in the normal group[（0.24±0.08），P<0.01]，and in the treatment group was（3.27±0.29），significantly lower than in the model group （P<0.01）；the Flameng semiquantitative score of hepatic mitochondria in the model group was（3.24±0.21），significantly higher than that in the normal group[（0.17±0.03），P<0.01]，and in the treatment group was（1.39±0.12），significantly lower than that in the model group （P<0.01）；immunohistochemical staining showed that SIRT3 protein appeared both in the cell nucleus and cytoplasm，and the Western blot quantitative detection of SIRT3 protein showed that it was（0.24±0.03） in the model group，significantly lower than that in the normal group [（0.58 ±0.02），P<0.01]，and in the treatment group was （0.46±0.03），significantly higher than that in the model group （P<0.01）.ConclusionThe SIRT3 expression is decreased in liver tissues of rats with NASH，and resveratrol intervention can improve the expression of the protein，which might alleviate NASH.

Nonalcoholic steatohepatitis；Silent mating type information regulation 2 homolog 3；Resveratrol；Rats

大连市医学卫生科学研究计划项目（编号：2016142）

116001辽宁省大连市 大连大学（陈娟，梁凯）；附属中山医院消化内科（孔维宗，王迎春）

陈娟，女，27岁，硕士研究生。主要从事非酒精性脂肪性肝病防治研究。E-mail：chj_0130@163.com

王迎春，E-mail:wych_1648@126.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.04.006