一株烟碱降解菌的筛选鉴定与降解特性研究

方 超， 阮爱东

（1.河海大学水文水资源学院， 江苏 南京 210098；2.水文水资源与水利工程科学国家重点实验室， 江苏 南京 210098）

0 引言

烟碱作为烟草中重要的生物碱，俗称尼古丁，是衡量烟叶品质和工业可用性的关键指标[1]，也是烟草工业废水和烟草废弃物的主要有害成分。烟碱具有毒性，低浓度使人兴奋，高剂量摄入可造成生物体迅速死亡[2]。目前我国部分烟区所产烟叶，尤其是上部烟叶烟碱含量偏高[3]。正常情况下烟碱质量分数烤烟应低于3%，白肋烟应为2%～4%，而我国烤烟烟碱质量分数平均为3%～4%，白肋烟达6%[4]。如何降低烟叶中的烟碱含量到可用范围内，提高烟叶品质和工业可用性，是卷烟行业亟待解决的热点课题。

我国是世界上最大的烟草生产国，每年约有近25%的烟叶、烟末等下脚料被废弃[5]，每千克这些废弃物中含有约2 000 mg的烟碱[6]。如果对这些高毒性废弃物不给予合适地处理，它们会逐渐通过 “土壤－水－人体”或“土壤－植物－人体”等途径，改变土壤结构[7]，污染地下水，间接被人体吸收，严重威胁人群健康和生态安全[8]。

微生物降解环境污染物具有高效经济，不易造成二次污染的优点[9]。许多研究表明烟碱可被少数微生物利用并降解[10-12]。早在1947年ENDERS等[13]就发现酵母对烟碱存在降解作用，但不能完全降解烟碱。袁勇军等[14]从福建三明地区的土壤中筛选到一株中间苍白杆菌，对质量浓度0.5 g/L的烟碱，36 h内降解率为97.65%。李晓华等[15]从湖北省襄阳烟草种植地也分离到一株中间苍白杆菌，烟碱质量浓度为1 g/L时，降解率达88.33%，烟碱质量浓度为3 g/L时，菌株生长受到抑制。这些降解菌多数适应烟碱的起始浓度比较低，降解条件不够宽泛，实际应用中，烟碱耐受性强、降解效率高的菌株仍十分匮乏。

以烟碱为唯一碳氮源，分离得到一株烟碱降解菌，完成种属鉴定和降解性能研究，并对各种培养条件下，菌株代谢烟碱的能力进行了检测分析。旨在丰富烟碱降解的工程菌资源，为微生物在烟草工业和环境治理的应用建立基础。

1 材料与方法

1.1 材料

土壤样品采自合肥卷烟厂堆积烟草废弃物超50 a的土壤。L-nicotine（纯度大于99%）购于德国默克化工技术有限公司。其它化学试剂均为分析纯或色谱纯。

培养基情况。①富集培养基成分：K2HPO40.2g/L，KH2PO40.8 g/L，MgSO40.2 g/L，CaSO40.1 g/L，NaMoO40.003 3 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L，C6H12O61 g/L，烟碱0.5 g/L，pH值=7.0；②无机盐选择培养基（ISM）组成成分：K2HPO40.2g/L，KH2PO40.8g/L，MgSO40.2 g/L，CaSO40.1g/L，NaMoO40.0033g/L，FeSO4·7H2O 0.005g/L，烟碱（根据实验需要添加），pH值=7.0。固体培养时在ISM中加入1.5%～2.0%琼脂。所有培养基在121℃下高压蒸汽灭菌25 min。烟碱经0.22 μm滤膜过滤后加入。

1.2 烟碱降解菌的筛选

在100 mL富集培养基中加入2 g样品土壤，30℃，150 r/min下富集7 d。取培养液至新鲜的ISM（烟碱质量浓度1 g/L），相同条件培养7 d，重复3次。取培养液稀释涂布在ISM琼脂培养基上，30℃培养48 h挑取单菌落，划线在新鲜的ISM琼脂培养基上，直至获得纯化的菌。

1.3 菌种鉴定

1.3.1 形态结构观察及生理生化实验

参照文献[16]《常见细菌系统鉴定手册》进行。

1.3.2 16S rDNA序列测定及系统发育分析

细菌总DNA用DNA抽提试剂盒提取。使用细菌通用引物（上海生工公司合成）进行PCR反应[17]。正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和反向引物：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。 PCR产物的纯化和测序由上海生工公司完成。测序结果利用Blast在GenBank数据库中进行相似性比较和鉴定，并用软件MEGA 5.05构建系统发育树。

1.4 培养条件对菌株生长和降解能力的影响

温度的影响：将 100 μL 菌液（OD600nm为 0.481）接种到100 mL烟碱质量浓度1.5 g/L的ISM中，150 r/min、不同温度（25，30，35，40 ℃）下培养。

初始pH值的影响：将100 μL菌液 （OD600nm为0.504）接种到100 mL烟碱质量浓度1.5 g/L的ISM中，150 r/min、最适温度、不同 pH 值（5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0）下培养。

初始烟碱浓度的影响：将100 μL菌液（OD600nm为 0.468）接种到 100 mL不同烟碱质量浓度（1，2，3，4，5，6，7，8 g/L）的 ISM 中，150 r/min、最适温度和 pH值下培养。

接种量的影响： 分别将 100，300，900 μL 菌液（OD600nm为0.487）接种到100 mL烟碱质量浓度1 g/L的ISM中，150 r/min、最适温度和pH值下培养。

外加碳源和氮源的影响：将100 μL菌液（OD600nm为0.533）接种到100 mL含不同碳源（葡萄糖质量浓度1 g/L，乙醇质量浓度1 g/L，乙酸钠质量浓度1 g/L）和含不同氮源（硫酸铵0.002mol/L，硝酸钾0.004mol/L，亚硝酸钠0.004 mol/L），及不外加碳氮源的ISM（烟碱质量浓度2 g/L）中，150 r/min、最适温度和pH值下培养24 h。

以上实验组均设3个平行。定时检测菌株生长和烟碱降解情况。

1.5 静息细胞对烟碱的降解

取对数生长期菌液，离心（相对离心力12 000×9.8 m/s2，离心时间 10 min，温度 4 °C）后用 50 mL 磷酸缓冲液（pH值=7.0）清洗3次，重悬浮于等体积的上述缓冲液，最终OD600nm为0.976。加入质量浓度4 g/L的烟碱，150r/min、最适温度和pH值下培养，定时检测烟碱的降解。

1.6 分析方法

烟碱的测定：培养物离心（相对离心力12 000×9.8 m/s2，离心时间 10 min，温度 4 °C）取上清，用高效液相色谱（HPLC，Agilent 1260 Infinity）检测烟碱浓度。 色谱条件：Ultimate XB-C18（4.6×250mm），流动相为甲醇：0.1%三乙胺（40：60，v/v），流速 1 mL/min，柱温 35 °C，检测波长 254 nm，进样量 5 μL。

生物量的测定：培养物离心（相对离心力12 000×9.8m/s2，离心时间 10 min，温度 4°C）得菌体，用 50mL磷酸缓冲液（pH值=7.0）清洗3次，重悬浮于等体积的上述缓冲液。用紫外分光光度计测定600 nm处的OD值。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选和鉴定

分离的菌株编号为pRF-1，能以烟碱为唯一碳源、氮源和能源生长。在ISM琼脂培养基上菌落呈钮扣状，淡黄色，不透明，表面粗糙，中央隆起，边缘扁平。生理生化鉴定结果见表1。菌株pRF-1好氧，革兰氏阴性，氧化酶、接触酶反应阳性，M.R.，V-P反应阴性，氧化葡萄糖产酸不产气，能还原硝酸盐为亚硝酸盐。与恶臭假单胞菌较接近，初步鉴定为假单胞菌属（Pseudomonassp.）[16]。

表1 菌株pRF-1的生理生化特征

图1 系统发育树

菌株pRF-1的16S rDNA序列在GenBank中登录号为KU363014。利用Blast进行序列同源性分析，结果表明菌株pRF-1与Pseudomonas plecoglossicida的多个菌株同源性均在99%以上，确定菌株pRF-1为假单胞菌属（Pseudomonassp.）。该菌株的系统发育树见图1。

2.2 菌株pRF-1的烟碱降解特性

2.2.1 培养温度对菌株pRF-1生长和降解特性的影响

用烟碱残余浓度和OD600nm值表示烟碱降解和菌株pRF-1生长情况。

在初始pH值为7.0，烟碱质量浓度为1.5 g/L的条件下，菌株pRF-1摇床培养30 h后，在温度为30℃时，生长量最高，能完全降解加入的烟碱，温度对菌株生长和烟碱降解的影响见图2。当温度超过35℃，菌株生长迟缓，烟碱降解率快速下降。大部分假单胞菌属微生物最适生长温度在30℃左右[18]，温度过高，一方面菌株难以生长，一方面酶活性受到抑制，都会制约烟碱的降解。

图2 温度对菌株生长和烟碱降解的影响

2.2.2 初始pH对菌株pRF-1生长和降解特性的影响

初始pH值对菌株生长和烟碱降解的影响见图3。

图3 初始pH值对菌株生长和烟碱降解的影响

在培养温度为30℃，烟碱质量浓度为1.5 g/L的条件下，初始pH值为6.5～7.5时，菌株pRF-1经30 h摇床培养，均能完全降解加入的烟碱，当初始pH值为7.0，菌株生长最好。初始pH值小于5.0或大于9.0时，菌株生长明显受到抑制，烟碱几乎不降解。与已报道的Pseudomonassp.HF-1[19]和Pseudomonas stutzeriZCJ[20]相比，菌株pRF-1适应初始pH的能力更强，单位时间代谢烟碱的效率更高。

2.2.3 初始烟碱浓度对菌株pRF-1生长和降解特性的影响

在pH值为7.0，培养温度为30℃条件下，当初始烟碱质量浓度为1～4 g/L，菌株pRF-1在48 h内能完全降解烟碱（见图4）。

图4 初始烟碱浓度对菌株生长和烟碱降解的影响

由图4（a)可以看出，质量浓度为5 g/L时，烟碱降解率达96%。随初始烟碱质量浓度增加，降解率逐渐降低，但高达8 g/L时，降解率仍有50.72%。说明菌株pRF-1的烟碱耐受力非常高。以前报道的烟碱降解菌在低浓度烟碱环境中降解效果较好，但耐受的烟碱质量浓度有限，大多数在6 g/L以内，如Pseudomonassp.HF-1[19]，Pseudomonas stutzeriZCJ[20]和Pseudomonas putidaS16[21]的烟碱耐受质量浓度分别为2，4.5和6 g/L。本研究筛选的假单胞菌pRF-1在接种量仅为100 μL条件下，48 h内对质量浓度为8 g/L烟碱的降解率为50.72%，有望应用于高浓度烟碱环境，去除烟碱污染。

由图4（b）可以看出，烟碱降解和菌株生长均有一段迟缓期，并随初始烟碱浓度的提高，迟缓期逐渐延长，这一现象也见于其他烟碱降解菌的报道[19-22]。说明高浓度烟碱对菌株生长存在一定的抑制作用。初始烟碱质量浓度为4 g/L，菌株生长量最高。

值得关注的是，当烟碱降解完全后，菌株仍保持较长时间的快速生长，推测菌株pRF-1可以利用烟碱的降解产物。

2.2.4 接种量对烟碱降解的影响

图5 接种量对烟碱降解的影响

图6 外加碳源和氮源对烟碱降解的影响

接种量越大，菌株降解烟碱的速率越快（见图5）。接种量为 900 μL，相比 100 μL，烟碱降解的迟缓期有所缩短。

2.2.5 外加碳源和氮源对烟碱降解的影响

外加碳源和氮源对烟碱降解的影响见图6。

由图6可以看出，葡萄糖和乙酸钠对菌株pRF-1降解烟碱有促进作用，乙醇、硫酸铵和亚硝酸钠对菌株pRF-1降解烟碱有抑制作用，而硝酸钾则无影响。

2.3 静息细胞的烟碱降解性能

静息细胞条件下，菌株停止生长，依靠积累的酶来催化降解烟碱。静息细胞对烟碱的降解能力见图7。在含烟碱的磷酸缓冲液中，菌株pRF-1的静息细胞在22 h内完全降解质量浓度为4 g/L烟碱，最大降解效率为每小时降解247 mg的烟碱，说明静息细胞内存在高效的烟碱降解酶。在醇化烟叶或处理烟草废弃物时，可以直接通过喷洒事先培养好的菌液，催化降解烟碱，缩短处理时间。

图7 静息细胞对烟碱的降解能力

3 结论

（1）从堆积烟草废弃物的土壤中筛选得到一株能以烟碱为唯一碳源、氮源和能源生长的菌株，经形态学、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析，初步鉴定为假单胞菌属（Pseudomonassp.），命名为pRF-1。

（2）菌株pRF-1生长和降解烟碱的最适条件均为：温度30℃，初始pH值为7.0，此条件下，48 h内菌株对质量浓度为5 g/L的烟碱的降解效率达96%。菌株pRF-1耐受极高的烟碱浓度，烟碱质量浓度达8 g/L，48 h降解率仍有50.72%。

（3）可通过增大接种量或适当外加葡萄糖和乙酸钠促进菌株pRF-1对烟碱的降解效果。

（4）菌株pRF-1的静息细胞中存在高效的烟碱降解酶，在22 h内完全降解质量浓度为4 g/L的烟碱，说明菌株pRF-1可应用于烟叶醇化和烟草废弃物处理。