复方左炔诺孕酮阴道环中有关物质检测的方法学研究

郑 直 张 倩 宁美英

1.国家卫生计生委科学技术研究所药物和医用材料研究中心（北京，100081）；2.北京协和医学院研究生院

复方左炔诺孕酮阴道环中有关物质检测的方法学研究

郑 直1，2张 倩1，2宁美英1＊

1.国家卫生计生委科学技术研究所药物和医用材料研究中心（北京，100081）；2.北京协和医学院研究生院

目的：建立复方左炔诺孕酮（LNG）阴道环中有关物质的高效液相色谱（HPLC）检测方法，并对该方法进行方法学研究。方法：经紫外光谱法确定吸收波长，利用双波长法进行HPLC的检测。在强酸、强碱、高温、氧化剂、强光照等条件下，分别对注塑成型法制备的LNG和炔雌醇（EE）阴道环进行破坏试验。利用HPLC法考察阴道环的稳定性、精密度、检测限等。实验方法为色谱柱DiamonsilR C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相乙腈－水体积比5248；LNG和EE的检测波长分别为240nm和205nm；柱温35℃；流速1.0ml／min。结果：专属性实验结果显示，复方LNG阴道环主成分与相关杂质及降解产物均分离良好，空白辅料对测定无干扰。结论：所建立的复方LNG阴道环中有关物质的测定方法操作简单、专属性强、重复性好。

左炔诺孕酮；炔雌醇；阴道环；方法学验证；高效液相色谱

左炔诺孕酮（LNG）是一种最为常用的第二代孕激素类避孕药物，拥有良好的临床使用效果和可接受性。炔雌醇（EE）是一种半合成强效固醇类雌激素，通常与LNG同时使用制备复方制剂，以提高避孕效果及适应性［1］。阴道环给药具有缓释，甚至一定时间内稳定释放的能力［2－3］，药物经阴道黏膜吸收入血，发挥阴道局部或全身的治疗作用［4－5］。与其他制剂相比，阴道环给药具备以下优点：避免肝脏的首过效应，提高药物的生物利用度［1］；可自行取放，使用方便；加载在阴道环中的药物能够达到缓释的效果，避免了大突释产生的风险。本实验采用注塑成型法制备复方LNG阴道环，能够使药物均匀分散到硅胶中形成性质稳定的阴道环，达到缓释的目的［811］。本文建立复方LNG阴道环中有关物质的高效液相色谱（HPLC）检测方法，并进行方法学研究。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

LNG原料药（批号：70801509004，秦皇岛紫竹药业有限公司）、EE原料药（批号：73801506002，秦皇岛紫竹药业有限公司）、MED－6382液体硅橡胶（批号：70726，美国Nusil Technology）。

1.2 仪器

Sartorius－BT 224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、CSR－4－10超纯水机（北京爱斯泰克科技开发有限公司）、阴道环模具（北京东洛机电有限责任公司）、Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2487紫外检测器、Waters 2414柱温箱、自动进样器、Empower色谱工作站（Waters公司）。

1.3 阴道环的制备

1.3.1 EE阴道环 将阴道环模具放到80℃的烘箱中预热15min。称取EE 48mg、MED6382硅胶8 g，混合均匀后加入催化剂，继续搅拌约15s。快速将混合物加入到10ml注射器中，匀速且快速地注入到预热好的模具中。将模具放到80℃烘箱中加热30min，成型后开模取出即得。

1.3.2 LNG阴道环 将阴道环模具放到80℃的烘箱中预热约15min。称取LNG 400mg、MED6382硅胶8g，混合均匀后加入催化剂，继续搅拌约15s。快速将混合物加入到10ml注射器中，均匀快速的注入到预热好的模具中。将模具放到80℃烘箱中加热30min，成型后开模取出即得［3－4］。

1.4 实验方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱DiamonsilR C18（250mm ×4.6mm，5μm）；流动相乙腈－水（52：48，v／v）；LNG和EE的检测波长分别为240nm和205nm；柱温35℃；流速1.0ml／min。

1.4.2 供试品溶液的配制 分别取1／2的LNG阴道环和1／8EE阴道环，切成0.5mm薄片，分别置于装有100ml甲醇的锥形瓶中，室温下磁力搅拌36h和24h后冰浴超声2h，经0.45μm滤膜滤过。LNG组取续滤液1.0ml于50ml量瓶中，EE组取续滤液3.4ml于25ml量瓶中，分别用乙腈－水（体积比5248）稀释至刻度，摇匀，分别作为LNG、EE供试品溶液，于4℃冷藏备用。

1.4.3 自身对照溶液的配制 精密量取LNG、EE供试品溶液各1.0ml，分别置于100ml量瓶中，用乙腈－水（体积比5248）稀释至刻度，摇匀，得LNG、EE对照溶液，于4℃冷藏备用。

1.5 专属性试验

1.5.1 空白干扰试验 按照1.3的方法，制备两个空白阴道环，再将其均匀切成薄片（厚度0.5mm）置于装有100ml甲醇的具塞锥形瓶中，分别磁力搅拌36h和24h后分别冰浴超声2h，经0.45μm滤膜滤过，配置供试品溶液，进样分析，记录色谱图。

1.5.2 酸破坏 分别取1／2的LNG阴道环和1／8EE阴道环，切成0.5mm薄片，分别置于具塞锥形瓶中，再分别加1mol／L盐酸溶液适量，于室温放置24h，加0.1mol／L NaOH溶液调节至中性，加100 ml甲醇。对于LNG溶液，室温下磁力搅拌24h后冰水浴下超声2h；对于EE溶液，室温下磁力搅拌36h后冰水浴下超声2h。经0.45μm滤膜滤，取续滤液3.5ml稀释成25ml。HPLC进样得到峰面积数据。

1.5.3 碱破坏 分别取1／2的LNG阴道环和1／8EE阴道环，切成0.5mm薄片，分别置于具塞锥形瓶中，加入0.1mol／L NaOH溶液适量，于室温放置24h，加0.1mol／L盐酸溶液调节至中性，再加100ml甲醇。同上述方法制备供试品溶液，HPLC进样得到峰面积数据。

1.5.4 氧化破坏 分别取1／2的LNG阴道环和1／8EE阴道环，切成0.5mm薄片。加3%过氧化氢试液适量，室温放置8h，加100ml甲醇。同上述方法制备供试品溶液，HPLC进样得到峰面积数据。

1.5.5 高温破坏 分别取1／2的LNG阴道环和1／8EE阴道环，切成0.5mm薄片，分别置于具塞锥形瓶中，于60℃烘箱中放置24h后取出，放至室温，加100ml甲醇。同上述方法制备供试品溶液，HPLC进样得到峰面积数据。

1.5.6 光照破坏 分别取1／2的LNG阴道环和1／8EE阴道环，切成0.5mm薄片。分别于（4500± 500）Lx光照条件下放置48h，置于具塞锥形瓶中，加100ml甲醇。同上述方法制备供试品溶液，HPLC进样得到峰面积数据。

1.5.7 检测限 分别取两溶液的0.01μg／ml的标准溶液不断稀释，按照1.4.1色谱条件进行检测，直到S／N为3／1，分别得到两者的检测限。

1.6 重复性试验

取同一批号样品，平行制备供试品溶液6份，以预定的方法测定，得到HPLC结果，计算测定的结果相对标准偏差（RSD）。

1.7 溶液稳定性试验

取LNG、EE供试品溶液，照预定的色谱条件，分别于0、4、8、12、24h时进样，记录主成分、有关物质及杂质的峰面积，考察样品稳定性。

1.8 有关物质检查

取3批LNG和EE阴道环，制备LNG、EE供试品溶液及自身对照溶液，分别精密量取100μl及自身对照溶液100μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%，再精密量取供试品溶液和对照液各100μl，分别进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，用自身对照法计算杂质的含量。

2 结果

2.1 专属性实验

2.1.1 空白干扰试验 LNG和EE载药阴道环经过各自相同处理的空白阴道环提取液的HPLC图谱显示，在相应的保留时间（箭头所示）下并无其他的吸收峰出现，说明空白硅橡胶辅料环并不会对LNG和EE的相关检测产生干扰。见图1、图2。

2.1.2 强制降解试验 结果见图3～14所示。图4～8与图谱3的对比和图9与图10～14的对比均表明，样品经酸、碱、氧化、高温、光照破坏后，两药会有轻微的降解，但是各降解产物峰与主要两峰之间均可达到良好分离。

图1 LNG检测条件下辅料的HPLC图谱

图2 EE检测条件下辅料的HPLC图谱

图3 未经破坏的阴道环中LNG的HPLC图谱（tR＝12.98min）

图4 阴道环中LNG在酸破坏下的HPLC图谱（tR＝12.98min）

图5 阴道环中LNG在碱破坏条件下的HPLC图谱（tR＝12.98min）

图6 阴道环中LNG在氧化破坏条件下的HPLC图谱（tR＝12.98min）

图7 阴道环中LNG在高温破坏条件下的HPLC图谱（tR＝12.98min）

图8 光照破坏条件下阴道环中LNG的HPLC图谱（tR＝12.98min）

图9 阴道环中EE在未处理时的HPLC图谱（tR＝8.28min）

图10 阴道环中EE在酸破坏条件下的HPLC图谱（tR＝8.28min）

图11 阴道环中EE在碱破坏条件下的HPLC图谱（tR＝8.28min）

图12 阴道环中EE在氧化破坏条件下的HPLC图谱（tR＝8.28min）

图13 阴道环中EE在高温破坏条件下的HPLC图谱（tR＝8.28min）

图14 阴道环中EE在光照破坏条件下的HPLC图谱（tR＝8.28min）

2.2 检测限

由样品HPLC进样后出峰结果分析可知，LNG和EE的检测限分别为3ng／ml和5ng／ml。

2.3 重复性实验

6份供试品溶液中LNG和EE的杂质总合RSD分别为1.7%和0.7%，统计学计算结果表明方法的重复性良好。

2.4 溶液稳定性实验

LNG和EE供试品溶液在24h内杂质峰面积综合RSD分别为1.6%和0.9%，表明两供试药物在24h内均基本稳定。

2.5 有关物质检查

3批样品定量测定结果见表1。统计结果显示，所制备的3批样品分别在LNG、EE检测下的每种检测到的杂质的含量，即单杂质和杂质含量的总和，即总杂质含量均低于0.5%。

表1 两种检测样本有关物质的检测杂质情况（%）

3 讨论

2015版药典并未收录LNG阴道环有关物质的检测方法，本实验采用控制变量法等对复方LNG阴道环中有关物质检测进行了方法学研究，所用标准为2010版药典二部药品质量标准指导原则。

3.1 流动性相的选择

本实验是从原有基础上的乙腈水体积比为7030的比例不断调节，使得保留时间停留在合适的区段，最终选择了乙腈水为5248的比例。在该比例下，末端吸收无影响，分离效果好，选择性好，峰形好。紫外可见光波长扫描结果显示，LNG和EE的最大吸收波长分别为240nm和205nm，且在各自的最大吸收波长下，另一种药物的吸收很小。在阴道环载药的体外试验中，LNG和EE的释药量相对较小，在介质中浓度低，所以在HPLC检测中，采用了两者的最大紫外吸收波长进行双波长检测，相较于原有的单一波长检测更准确且直观。

3.2 实验条件的设定原理

两种药物制得的阴道环的提取方法和EE的检测方法参考了李春晓［9］的研究数据；LNG则是采用了控制变量的方法不断对各个项目进行实验最终确定，磁力搅拌24h，加冰水浴下超声2h，得到的提取效率最佳。硅橡胶中加入了交联催化剂，使得其交联良好，因此加载在阴道环中的药物，提取有一定的困难。所以在磁力搅拌的条件下继续进行了超声提取，使其中药物能够很好被提取出来。

3.3 方法学验证

本文中采用了不加校正因子的主成分自身对照法对复方LNG阴道环中的有关物质进行检测。结果显示有关物质及杂质含量均低于限定量（0.5%），不会对主药的测定产生干扰。专属性实验结果表明，LNG及EE能够与降解产物良好分离，且空白阴道环不对主药的HPLC检测结果产生干扰。从而证明该HPLC检测方法专属性强，可用于复方LNG阴道环中有关物质的检测。

复方LNG阴道环中有关物质的测定方法还未见报道，本研究着重优化了检测波长，采用了双波长检测法，经方法学验证此法专属性强，灵敏度高，且符合药典等相关规定要求，能够为复方LNG阴道环中有关物质的测定提供科学依据。

参考文献

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［责任编辑：张 璐］

The methodology study on the detection of the related substance in compound levonorgestrel vaginal ring

Zheng Zhi1，2，Zhang Qian1，2，NING Meiying1＊
1.Centre of Drugs and Medical Polymer Materials，National Research Institute for Family Planning，Beijing，100081；2.Graduate School of Peking Union Medical College.
＊

mayning999＠126.com

Objective：To construct High Performance Liquid Chromatography（HPLC）method for detecting the relative substance in compound Levonorgestrel vaginal ring，and then to study on methodology of this HPLC method.Methods：The absorbing wavelength was decided by the ultraviolet ultraviolet spectrometry method.Then the HPLC method was detected by the dual wavelength detection method.The compound LNG vaginal ring was synthesized by the way of injection molding，and then breaking test of the compound LNG vaginal ring conducted under the condition of strong acid，strong alkaline，high temperature，oxidizing agent and strong illumination.And the repeatability，stability，accuracy，and the limit of detection（LOD）of the ring were also detected by HPLC method.The chromatographic condition included that，chromatographic column was Diamonsil R C18（250mm×4.6mm，5μm），mobile phase was acetonitrile water 52：48，detection wavelength of LNG was 240nm and detection wavelength of EE was 205nm，column temperature was 35℃and flow rate was 1.0ml／min.Results：The result of specificity test showed that，the main peak and the correlated peaks were well separated.Blank excipient couldn’t affect the main peaks.Conclusion：The established method for testing compound LNG vaginal ring has the characteristics of operative simplicity，strong specificity and good repeatability.

Levonorgestrel；Ethinyloestradol；Vaginal ring；Methodology study；HPLC

10.3969／j.issn.1004－8189.2017.05.002

“十三五”国家重点研发计划课题（2016YFC1000904）

2016－10－08

2016－12－21

＊通讯作者：mayning999＠126.com