维药鸢尾根提取物抑制变异链球菌生物膜的初步研究

马 玉 田春鸿 孙丽婷 田 莉 刘 盟

1.新疆乌鲁木齐市第四人民医院检验科，新疆 乌鲁木齐 830002；2.新疆乌鲁木齐市米东区中医医院，新疆 乌鲁木齐 831400；3.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011; 4.新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐 830011

维药鸢尾根提取物抑制变异链球菌生物膜的初步研究

马 玉1田春鸿2孙丽婷1田 莉3*刘 盟4

1.新疆乌鲁木齐市第四人民医院检验科，新疆 乌鲁木齐 830002；2.新疆乌鲁木齐市米东区中医医院，新疆 乌鲁木齐 831400；3.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011; 4.新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐 830011

目的：研究维药鸢尾根不同极性提取部位对变异链球菌生长及生物膜形成的影响，为其防治龋齿的活性部位提供实验依据。方法：采用系统溶剂法分离维药鸢尾根不同极性提取物，微孔板法培养变异链球菌BF模型，两倍稀释法研究维药鸢尾根不同极性提取物对变异链球菌的最低抑菌浓度(MIC)和影响BF形成的最低抑菌浓度(SMIC)。结果：乙酸乙酯提取部位对抑制变异链球菌生长的MIC50为500μg/mL，氯仿、乙酸乙酯提取部位对变异链球菌BF形成的SMIC50分别约为125μg/mL和50μg/mL。结论：初步确定维药鸢尾根氯仿、乙酸乙酯提取部位为抑制变异链球菌BF形成的活性部位。

维药鸢尾根；提取物；变异链球菌；生物膜

鸢尾根为鸢尾科植物喜碱鸢尾(Irishalophilapall.)的干燥根茎，收载于《中华人民共和国卫生部标准》(维吾尔药分册)，其性干热，具有成熟和清除异常体液，促进机体自然随和的功效，用于治疗咽喉肿痛、牙痛、疮痈、湿疹等症[1]。文献报道和前期实验表明，喜碱鸢尾根中含有黄酮类、内酯香豆素、糖和苷类，酚类鞣质、有机酸等成分，对其抗氧化活性成分的分离鉴定和挥发性成分的检测有相关报道[2-3]。

变异链球菌是龋病者口腔中分离出的主要致龋菌，其通过牙齿表面黏附和聚集形成生物被膜，即牙菌斑生物膜(Biofilm，BF)，进而产酸耐酸致龋，抑制其BF形成能有效防治龋病，成为近年防龋研究的热点[4]。鉴于鸢尾根的临床适应症和维吾尔民间用其治疗牙痛、疖疮痈疽、口疮等症，本文研究其不同极性提取部位对变异链球菌的生长及其BF形成的影响，筛选其防治龋病的活性部位，为其防治龋病制剂开发和临床应用提供实验依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器 Spectra-MAX 190酶标仪(美国Molecu1ar Devices公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；DNP-9162型恒温培养箱(上海精宏设备公司)；3110型CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；BT-25S型分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；96孔微量培养板(美国Corning公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂)。

1.2 供试菌种和试剂 变异链球菌(ATCC 700610，中国药品生物制品检定所)；脑心浸液培养基(Brain Heart Infusion Broth，BHI，美国BD公司)；去氧胆酸钠(SD，Sigma-Aldrich)；其它试剂均为分析纯。

1.3 药品 鸢尾根购于新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，经新疆医科大学乌莉娅·沙衣提教授鉴定为喜碱鸢尾(Irishalophilapall.)的干燥根茎。

2 方法

2.1 鸢尾根不同极性部位提取物的制备 称取鸢尾根粗粉500g，加入75%乙醇3000mL热回流提取3次，2h/次，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，烘干，得稠浸膏66.9g。所得浸膏再依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取，各萃取液经减压浓缩，烘干，得到4个不同极性部位提取物，4℃保存。

2.2 抑菌试验

2.2.1 菌种复苏与培养 在-80℃保存的变异链球菌接种于BHI培养基中，在37 ℃、5%、 CO2培养箱孵育20h后，比浊法判断菌种已复苏。用接种针挑取少量标准菌种，划线接种于灭菌的琼脂固体培养基中，37℃ 、5% 、CO2培养箱中孵育24h[5]。

2.2.2 菌悬液的制备 用无菌接种环挑取纯化培养的变异链球菌置BHI培养基中，加入40%葡萄糖，在37 ℃ 5% CO2培养箱中活化孵育24h，使变异链球菌处于指数生长期，充分震摇后，经麦氏比浊管法调整菌液浓度为109CFU/mL。

2.2.3 样品制备 分别精密称定鸢尾根不同极性提取物适量，以二甲基亚砜分别制成约2mg/mL实验样品溶液，阿莫西林制成250μg/mL溶液，均以0.22μm滤器过滤除菌，4℃冰箱保存备用。

2.2.4 对变异链球菌生长的影响 采用2倍稀释法测定鸢尾根不同极性提取物对变异链球菌生长的影响，并确定最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)[6]。用BHI培养液50倍稀释变异链球菌悬液，用此悬液将“2.2.3”鸢尾根不同极性提取物实验样品溶液进行连续对倍稀释，使含药终浓度分别为1000、500、250、125、62.5μg/mL。同时，设25%二甲基亚砜-甲醇作为空白溶剂对照，含菌溶液作为阴性对照，阿莫西林作为阳性对照，平行3个复孔，于37 ℃ 5% CO2培养箱孵育18h，酶标仪在600nm波长处测定光密度值(OD值)，计算抑制率。计算公式为：抑制率(%)=[(OD空白溶剂- OD样品)/(OD空白溶剂OD阴性对照)]×100%，并确定最低抑菌浓度(MIC值)[7]。

2.2.5 对变异链球菌BF形成的影响 将培养至对数生长期的变异链球菌接种于96孔板，以未加样品含菌溶液作为阴性对照，50μg/mL阿莫西林溶液作为阳性对照，实验样品组分别加入含1000、500、250、125、62.5μg/mL鸢尾根不同极性提取物的BHI培养液。平行3个复孔，培养24h，去除培养基及悬浮细菌，蒸馏水冲洗3遍，每孔加200μL 1%结晶紫溶液染色15min，双蒸水冲洗数遍至透明，用2% SD洗脱生物膜，酶标仪在600 nm波长处测定OD值，计算抑制BF形成的抑制率。计算公式为：抑制率(%)=(OD阴性对照-OD样品/ OD阴性对照)×100%，并确定抑制BF形成的最低抑菌浓度(Sessile Minimal Inhibitory Concentration，SMIC)[8]。

3 结果

3.1 不同极性鸢尾根提取物对变异链球菌的抑菌率 测定样品的OD值计算抑制率，鸢尾根的乙酸乙酯提取物对变异链球菌的生长有抑制作用，依据MIC的判断标准，确定乙酸乙酯提取物抑制变异链球菌生长的MIC50为500μg/mL，阳性组抑制率为(100±0.89)%。结果见表1。

表1 鸢尾根不同极性提取物对变异链球菌生长的抑制率 (%，n=3)

3.2 对变异链球菌BF形成的影响 测定测定样品的OD值计算抑制BF形成的抑制率，鸢尾根的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物对变异链球菌BF形成均有一定的抑制作用。初步确定氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取部位对变异链球菌BF形成的SMIC50分别约为125μg/mL、 500μg/mL和500μg/mL。见表2。

表2 鸢尾根不同极性提取物对变异链球菌BF形成的抑制率 (%，n=3)

注：与阴性对照组相比，＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。

维药鸢尾根石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物对变异链球菌BF形成均有抑制作用，且呈剂量依赖性，各组抑制率与阴性对照组(0μg·mL-1)比较，差异有统计学意义(P<0.001)，其中石油醚萃取物与氯仿、乙酸乙酯萃取物相比较弱(P<0.001)，与乙酸乙酯萃取物相比，载体表面活菌数多但差异无统计学意义(P>0.05)， 维药鸢尾根氯仿萃取物1000μg·mL-1时抑制变异链球菌BF形成活性明显，阳性组抑制率为(84.13±1.74)%，二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。 以上结果表明维药鸢尾根不同极性萃取部位均有一定的体外抑制变异链球菌BF的形成。

4 讨论

细菌BF是不同于浮游菌的另一种细菌存在形式，由细胞外保护性基质和包裹其中的细菌群落组成，比浮游菌的代谢活性和对抗菌剂的敏感性均低，使其难以被消灭。变异链球菌及其在牙体表面黏附聚集形成的BF是致龋的主要因素，抑制其形成BF是防龋研究的关键[9]。目前临床主要使用氯己定、季胺类化合物、金属纳米颗粒及抗菌肽等变异链球菌抗菌剂，并不能有效清除细菌BF，易产生耐药性;同时，还存在引起味觉改变、菌群失调、细胞毒性及易被唾液蛋白酶降解等问题[10]。由于中药毒副作用小，提取物成分复杂，不易产生耐药作用。因此，从植物提取物中筛选抑制细菌BF形成的活性成分，对解决细菌耐药性及临床上与BF形成相关的顽固性、难治性感染等问题具有重要意义[11]。

喜碱鸢尾是盐生草本植物，喜生于草甸草原、山坡荒地及潮湿盐碱地，在新疆天山北麓一带广为分布，其抗旱、耐寒和抗虫害特性，具有可改良盐碱地、保持水土的生态价值[12]。对喜碱鸢尾根药用价值的研究可促进该植物的合理开发利用，但对喜碱鸢尾药效活性成分的系统研究较少。鸢尾根系维吾尔医的传统药材，临床用其治疗牙痛、咽喉肿痛、疮痈等症，尚未见对鸢尾根抑制致龋菌的相关研究。笔者研究维药鸢尾根不同极性提取部位对变异链球菌生长及其BF形成的影响，筛选其抑菌活性部位，为其防治龋齿药用价值提供实验依据。结果表明，鸢尾根不同极性提取物所含化学成分的类别和含量不同，使其抑菌活性存在差异。鸢尾根乙酸乙酯提取物可抑制变异链球菌生长，氯仿、乙酸乙酯提取物可抑制其BF形成，并具有剂量依赖性，可确定氯仿、乙酸乙酯提取物为抑制变异链球菌的有效部位。对鸢尾根抗菌有效部位的药效成分、抗菌种类、抑菌机理、富集与质量控制方法等确定，需进一步探索。

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Study on the Inhibitory Effect of Extracts from Uyghur Medicine Iris halophila pall.Root on Biofilm Formation of Stretopcoccus Mutans in Vitro

MA YU1TIAN Chunhong2SUN Liting1TIAN Li3*LIU Meng4

1. Department of Clinical Laboratory, The Fourth People’ Hospital of Urumqi, Urumqi 830002,China;2.Chinese Medical Hospital of Midong District in Urumqi, Urumqi 831400, China;3. College of TCM, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011,China;4. Affiliated Tumor Hospital，Xinjiang Medical University, Urumqi 830011,China

Objective To study the inhibitory effect of the different solvent extracts from Uyghur medicineIrishalophilapall. root on the development of Stretopcoccus mutans and formation of biofilm(BF). It will provide the experiment basis for prevention and treatment dental caries. Methods The different polarity extracts of Uyghur medicineIrishalophilapall. root were obtained by system solvent separation method. Microwell plate method was used to cultivate Stretopcoccus mutans BF model. The minimum inhibitory concentration(MIC) and the SMIC against BF of the different solvent extracts were investigated by double dilution method. Results The MIC50of ethyl acetate extract was 500μg/mL.The SMIC50of the chloroform extract and ethyl acetate extract were 125μg/mL and 500μg/mL respectively. Conclusion The chloroform extract and ethyl acetate extract showed obvious activity against Stretopcoccus mutans BF, which are worth further studying.

Uyghur MedicineIrishalophilapall. Root; Extract; Stretopcoccus Mutans; Biofilm

新疆维吾尔自治区高校科研计划项目(XJEDU2009S62)，新疆医科大学“天山英才工程”专项基金项目(Y0382002)。

马玉(1981-)，女，汉族，学士，研究方向微生物检验。E-mail:67848101@qq.com

田莉(1975- )，女，汉族，博士，教授，研究方向中药民族药。E-mail: tianli109@126.com

R284.2

A

1007-8517(2017)15-0039-04

2017-06-07 编辑：梁志庆)