抗生素微生物检定法测定土霉素片含量的不确定度评定

李 俨，孙立丽，王婉婷

（吉林省吉林市食品药品检验所，吉林 吉林 132001）

·检验检测·

抗生素微生物检定法测定土霉素片含量的不确定度评定

李 俨，孙立丽，王婉婷

（吉林省吉林市食品药品检验所，吉林 吉林 132001）

目的 分析抗生素微生物检定法测定土霉素片含量的系统误差。方法 采用容量分析法操作。结果 土霉素片的含量为(101.6± 3.4)%。结论 该方法条理清晰、简便、准确，可有效评价土霉素含量测定所带来的不确定度，并能较好地分析其中每一个检验步骤带来的误差，以便综合性考虑该药品的质量。

抗生素微生物检定法；土霉素；含量测定；不确定度

土霉素片的含量测定按2015年版《中国药典（四部）》通则1201[1]“抗生素微生物检定法”第一法(管碟法)测定，是根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。由于管碟法的实验步骤较烦琐，使用的电子天平、单标线吸量管、容量瓶所带来的系统误差，双碟的制备，菌液的加入量，以及钢圈的放置，培养的温度等对结果的影响都很大，因此，每一个检验者得出结果后都需要评定不确定度，对于试验中误差较大的仪器及量具，应充分考虑准确度及精密度。特别对于一些稍低于含量限值90.0%或稍高于110.0%的压线结果，更要慎重对待，不仅要严格规范正确的操作步骤，还要评定结果的不确定度，综合考虑试验所带来的误差，客观评价药品质量[2－6]。为此，本研究中分析了抗生素微生物检定法测定土霉素片含量的不确定度，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

R200D型电子天平，ZY－300Ⅳ型抑菌圈测定仪，SPX－250B－Z型生化培养箱（北京赛多利斯公司）。

1.2 试药

土霉素标准品（中国食品药品检定研究院，批号为130305－200720）；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾为分析纯，水为灭菌水；土霉素片由吉林省赤峰蒙欣药业有限公司提供，批号分别为160512，160815，161025。

2 方法与结果

2.1 溶液制备[4]

标准品溶液：精密称取土霉素标准品（约相当于土霉素25 mg），置25 mL容量瓶中，加盐酸液（0.1 mol／L）5 mL，振摇，使土霉素溶解后，再加灭菌水稀释至刻度，制成每1 mL约含1 000 U的溶液，摇匀，精密量取上述溶液5 mL，置50 mL容量瓶中，加pH＝6.0的灭菌磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成100 U／mL的溶液，摇匀。分别吸取5 mL，置50 mL和25 mL容量瓶中，加灭菌缓冲液稀释至刻度，制成10 U／mL和20 U／mL的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液：取本品4片，研细，置500 mL容量瓶中，加盐酸液（0.1 mol／L）100 mL，振摇，使土霉素溶解后，再加灭菌水稀释至刻度，制成每1 mL约含1 000 U的悬浮液，摇匀，静置，精密量取悬浮液5 mL置50 mL容量瓶中，加pH＝6.0的灭菌磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成100 U／mL的溶液，摇匀。分别吸取5 mL，置50 mL和25 mL容量瓶中，加灭菌磷酸盐缓冲液稀释至刻度，制成10 U／mL和20 U／mL的溶液，摇匀，即得。

2.2 不确定度计算[5－7]

不确定度由标准品的称量、稀释，供试品的稀释及测量结果平均值引入，具体公式如下：

其中，M对为标准品取样量；f供为供试品的稀释因子；f对为标准品的稀释因子。

2.3 不确定度分量评估

2.3.1 标准品称量引入的不确定度分量 U（m对）

使用十万分之一天平称取土霉素标准品25 mg，精密称定，以天平的置信区间±0.02 mg(天平制造商给出)，按均匀分布，则由此带来的不确定度分量（U）为0.011 5 mg。

参考《化学分析中不确定度的评估指南》[8]，称量变动性（即称量重复性）的计算公式为 0.5×精度，得0.5×0.01 mg＝0.005 mg，则由天平带来的不确定度：

因2次称量，故天平带来的不确定度计算2次：

因此，则由天平带来的相对不确定度：

2.3.2 标准品稀释引入的不确定度分量 U（V对）

稀释过程分原液稀释、高浓度稀释和低浓度稀释。标准品原液稀释中使用了1个25 mL容量瓶，1个50 mL容量瓶和1个5 mL单标线吸量管；标准品高浓度稀释中使用了1个25 mL容量瓶和1个5 mL单标线吸量管；标准品低浓度稀释中使用了1个50 mL容量瓶和1个5 mL单标线吸量管。其不确定度来源均主要包括体积校准、充满液体至刻度的变动性（重复性）、环境温度与校正温度不同、人员读数4个方面。

1)50 mL容量瓶体积校准带来的不确定度

体积校准：《常用玻璃仪器检定规程》[9]规定，20℃时，50 mL容量瓶（A级）的容量允差为±0.05 mL，计算公式：

充满液体至刻度的变动性：根据《化学分析中不确定度的评估指南》[8]中给出的典型值，滴定管的变动性标准偏差为0.009 2 mL，即 U2（V对50）＝0.009 2 mL。

环境温度与校正温度不同：实验温度为25℃（水的膨胀系数为2.1×10－4／℃，p＝0.95，c＝1.96），体积变化 Δ V＝V×液体的膨胀系数×Δ T＝50 mL×2.1× 10－4×5＝0.052 5 mL，则其不确定度：

人员读数带来的不确定度：

因此，由50 mL容量瓶带来的合成不确定度：

2)25 mL容量瓶体积校准带来的不确定度

参照50 mL容量瓶的方法计算，由25 mL容量瓶带来的合成不确定度 U（V对25）＝0.105 mL。

3)由5 mL单标线吸量管带来的不确定度

体积校准：在20℃时，5 mL单标线吸量管（A级）的容量允差为±0.015 mL，则不确定度 U1（V对5）＝a／c＝0.008 66 mL。

充满液体至刻度的变动性：10 mL单标线吸量管的变动性标准偏差为0.009 2 mL。

环境温度与校正温度不同：参照50 mL容量瓶的方法计算，结果为0.002 68 mL。

人员读数：参照50 mL容量瓶的方法计算，结果为0.020 4 mL。

因此，5 mL单标线吸量管带来的合成不确定度：

4)标准品高浓度稀释中25 mL容量瓶及5 mL单标线吸量管体积校准带来的不确定度

参照上述标准品原液中的25 mL容量瓶和5 mL单标线吸量管的方法计算，结果 Urel（f对高）＝0.006 39。

5)标准品低浓度稀释中50 mL容量瓶及5 mL单标线吸量管体积校准带来的不确定度

参照上述标准品原液中的50 mL容量瓶和5 mL单标线吸量管的方法计算，结果不确定度：

2.4 供试品稀释引入的不确定度分量 U（V供）

稀释过程分原液稀释、高浓度稀释和低浓度稀释。供试品原液稀释中使用了1个500 mL容量瓶，1个50 mL容量瓶和1个5 mL单标线吸量管；供试品高浓度稀释中使用了1个25 mL容量瓶和1个5 mL单标线吸量管；供试品低浓度稀释中使用了1个50 mL容量瓶和1个5 mL单标线吸量管。参照标准品稀释引入的不确定度分量 U（V对）的方法计算，结果 Urel（f供原）＝0.007 59。

采用与标准品高浓度和低浓度同样的方法稀释，同理得出：

2.5 测量结果平均值带来的相对不确定度分量 Urel（P）

本试验独立测量2次，含量值分别为101.66%和101.59%。求出 P＝101.62%，Si＝0.049 5%。结果平均值带来的不确定度：

平均值的相对标准不确定度：

2.6 合成标准不确定度

合成标准不确定度：

2.7 扩展不确定度

2.8 报告结果

3 讨论

抗生素微生物检定法使用活菌检测，存在很多不确定性，同时操作点样也存在很多人为因素，每一步都容易导致结果的不确定性[10]。因此，考察土霉素片含量的不确定度是非常必要的，通过对不确定度的来源、分量进行评估，分析由于测量误差的存在，对被测量值的不能肯定的程度。反过来，也表明该结果的可信赖程度。不确定度是测量结果质量的指标。不确定度愈小，所述结果与被测量的真值愈接近，质量越高，水平越高，其使用价值越高；反之，结果的质量与价值也越低。对实验结果有异议的或边缘值有必要做不确定评估。按药典规定，抗生素微生物检定法可信率一般不得大于5%。误差分析中，以前用测量误差来表述测量不确定度，现在的定义更准确，是指测量所获得结果的不确定的程度。

实践发现，测量不确定度的来源有几个方面：取样的代表性不够；对环境条件的测量与控制不完善；对模拟仪器的读数存在人为偏移；测量仪器的分辨力或鉴别力不够；测量方法和测量程序人近似性和假定性。经评估，测定土霉素片的含量时，供试品和标准品稀释过程带来的误差最大。要减小其不确定度，研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应读取辅料下层的溶液切面，如沉淀较多，须待其下沉后再量取上层液；另外，一些辅料会吸附抗生素，应加以注意。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：160－165.

[2]王丽楠，杨美华，陈建民.不确定度分析在药物研究中的应用[J].中草药，2008，39（3）：464－467.

[3]刘新荣，肖辉川，苏敬武，等.卫生检验工作中测量不确定度的评定[J].现代测量与实验室管理，2005，13（4）：22－26.

[4]中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准·抗生素药品(第一册)[M].北京：人民卫生出版社，1989：4－5.

[5]国家质量技术监督局计量司.测量不确定度评定与表示指南[M].北京：中国计量出版社，2001：46－52.

[6]臧慕文.分析测试不确定度的评定与表示（I）[J].分析实验室，2005，24（11）：74－79.

[7]佘伟鸣.药品检验中测量不确定度的评定[J].中国新药杂志，2003，12（9）：775.

[8]中国实验室国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南[M].北京：中国计量出版社，2002：26－32.

[9]JJG196－2006，常用玻璃仪器检定规程[S].

[10]陆 明，范国荣，汪 杨，等.测量不确定度在药品领域的应用[J].医药导报，2013，32（8）：1053－1057.

Evaluation of Uncertainty in Content Determination of Terramycin Tablets by M icrobiological Assay of Antibiotics

Li Yan，Sun Lili，Wang Wanting
（Jilin Institute for Food and Drug Control，Jilin，Jilin，China 132001）

Objective To analyze the systematic errors in the determination of Terramycin Tablets by microbiological assay of antibiotics.M ethods The volumetric analysis was adopted.Results The content of Terramycin Tablets was（101.6±3.4）%.Conclusion The method is clear，simple and accurate，it can effectively evaluate the uncertainty caused by the content determination of terramycin，and can well analyze the errors caused by each inspection step in the determination of terramycin content，so as to comprehensively consider the quality of the drug.

microbiological assay of antibiotics；terramycin；content determination；uncertainty

R927.1

A

1006－4931(2017)16－0026－03

2017－03－15；

2017－05－03)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.16.008

李俨，女，大学本科，副主任药师，研究方向为药品检验新方法及标准提高，（电子信箱）1876702723＠qq.com。