甲状腺癌复发与BRAF基因突变的关系研究

宋传伟

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.16.019

[摘要] 目的 探讨BRAF基因突变与甲状腺癌复发之间的关系。方法 方便选择2014年4月—2015年4月期间该院收治的复发性甲状腺乳头状癌患者22例（复发组）的复发灶和原发灶标本为研究对象，再选择同期收治的无复发生存的甲状腺癌患者21例为对照组，分别对两组的BRAF基因进行测序，对T1799A位点的V600E突变情况进行观察。结果 复发组中复发病灶与原发病灶BRAF基因T1799A位点V600E突变率分别为50.00%（11/22）、60.00%（12/20），其中1例患者的复发灶BRAF基因为野生型，而原发灶为突变型；同时，对照组的BRAF基因1799A位点V600E突变率为22.73%（5/22）；两组的BRAF突变率比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 甲状腺癌复发与BRAF基因突变有关，BRAF基因突变患者术后更容易出现复发，并且原发灶基因表型与复发灶不一致。

[关键词] BRAF基因突变；复发；甲状腺癌

[中图分类号] R736 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）06（a）-0019-03

Research on Correlation between the Recurrence of Thyroid Cancer and BRAF Gene Mutation

SONG Chuan-wei

Department of Breast and Thyroid Surgery， Heze Municiple Hospital， Heze， Shandong Province， 274000 China

[Abstract] Objective To discuss the correlation between the recurrence of thyroid cancer and BRAF gene mutation. Methods The recurrence lesions and primary lesions specimens of 22 cases with papillary thyroid carcinoma admitted and treated in our hospital from April 2014 to April 2015 were selected and 21 cases of patients with thyroid carcinoma without recurrence admitted and treated in our hospital at the same period were selected as the control group， and the BRAF gene was sequenced， and V600E mutation at T1799A was observed. Results The V600E mutation rate at T1799A locus of recurrent lesions and primary lesions BRAF in the recurrence group was respectively 50.00%（11/22）and 60.00%（12/20）， and the recurrent lesion of BRAF gene of 1 case was wild type， but the primary lesion was mutation， at the same time， the V600E mutation rate at 1799A locus in the control group was 22.73%（5/22）， and the difference in the BRAF mutation rate between the two groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The recurrence of thyroid cancer is related to the BRAF gene mutation， and the patients with BRAF gene mutation are easy to reoccur， and the gene phenotypes of primary lesions are not consistent with recurrent lesions.

[Key words] BRAF gene mutation； Recurrence； Thyroid cancer

甲狀腺癌是比较常见的一种甲状腺恶性肿瘤，在全身恶性肿瘤中占有较高的比例，约为1%～3%左右，并且在头颈部肿瘤中具有较高的发病率，居于首位，常见症状有吞咽困难、声音嘶哑以及肿块等，不仅危害患者健康，还严重影响患者的正常生活和工作。当前临床上在治疗甲状腺癌时，有多种多样的方法，包括放射性核素治疗、内分泌治疗以及手术治疗等，大多数甲状腺癌患者可以获得较好的预后，但是少数患者术后会出现复发，并且预后较差。BRAF因子作为Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路的一个重要转导因子，长约190kb，位于人染色体7q34，通过丝氨酸苏氨酸蛋白激酶发挥作用，该酶通过ERK、MEK以及核内转录因子与细胞表面的RAS蛋白和受体相连接，启动多种因子，对细胞内多种生物学事件进行调控，包括细胞凋亡、分化以及生长等，有研究发现[1]，BRAF在甲状腺癌的高、中、低分化中具有较高的阳性表达率，并且肿瘤分化程度与其表达呈正比关系，可以作为判断患者预后的一个重要指标。因此，该文研究了2014年4月—2015年4月期间该院收治的复发性甲状腺乳头状癌患者22例与BRAF基因突变之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选择该院收治的复发性甲状腺乳头状癌患者22例（复发组）为研究对象，年龄22～80岁，平均（50.3±18.5）岁，其中15例为女性、7例为男性；再选择同期收治的21例无复发生存的甲状腺癌患者为对照组，其中8例为男性、13例为女性，年龄23～76岁，平均（50.1±18.6）岁。入选标准：①符合甲状腺癌诊断标准，且经病理学检查确诊；②经医院伦理委员会批准；③患者自愿参与，且签署同意书；④无重大内科疾病史、头颈部肿瘤病史以及术前治疗史。排除标准：①严重精神异常或意识障碍者；②不愿意参与研究者；③哺乳期或妊娠期妇女；④临床资料不完善者。两组的性别比、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 检测BRAF基因T1799A位点突变

将上述蜡块送至上海生物医药公司进行纯化处理后，运用聚合酶链反应进行扩增，然后直接测序，并且对比分析BRAF基因组DNA正常序列与所得结果，判断是否存在点突变。

1.2.1 提取DNA 按照常规方法，碾碎上述所取蜡块标本，对DNA进行提取，并且在-20°C条件下保存提取的DNA以备用。

1.2.2 PCR扩增目标片段 ①引物设计。选择上海生物医药公司合成的引物，引物序列如下：反向引物为5-GGCCAAAAAT-TTAATCAGTGGA-3，正向引物为5TCATAATGCTTGC-TCTGATAGGA-3，目标片段扩增后长度为224 bp。②PCR反应体系。通常情况下，PCR反应条件为：59.1°C退火30 s，94°C預变性3 min，72°C延伸30 s，94°C变性30 s，连续35个循环，然后在72°C中进行8min延伸后结束。PCR反应体系：17.8μl双蒸水，2.5 μL扩增缓冲液（含Mg2+）×10，正向引物和反向引物各0.5 μL（20 μmol/L），1.5 μlDNA模板，0.2 μL（5 U/μL）Tap DNA聚合酶，2.0 μL（10 mmol/L）dNTP，总体积为25 μL。

1.2.3 电泳检测PCR产物 为了确定PCR产物中存在目标DNA片段，在1.0 μL DNA加样缓冲液中加入5 μLPCR产物中均匀混合后加样，然后选择1.0 μL DNA标记物作为分子对照，在6%聚丙烯酰胺凝胶中进行AgNO3染色并行电泳。

1.2.4 PCR产物测序 在电泳检测中，确定为PCR产物后，将其送至上海生物医药公司进行纯化并测序，对比分析BRAF基因组DNA正常序列与所得结果，判断是否存在点突变。

1.3 统计方法

运用SPSS 15.5统计学软件分析数据，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

复发组中复发病灶与原发病灶BRAF基因T1799A位点V600E突变率分别为50.00%（11/22）、60.00%（12/20），其中1例患者的复发灶BRAF基因为野生型，而原发灶为突变型；同时，对照组的BRAF基因1799A位点V600E突变率为22.73%（5/22）；两组的BRAF突变率比较差异有统计学意义（χ2=9.273，P<0.05）。

3 讨论

近年来，甲状腺癌在我国的发病率呈现出明显的上升趋势，不仅影响患者的正常生活，已经成为危害社会公众健康的一种重要疾病。通常情况下，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在临床上又被称之为细胞外信号调节激酶，是MAPK信号传导通路的一个下游蛋白激酶，在肿瘤的发生、发展以及转移过程中发挥着极其重要的作用。有研究发现，MAPK通路串联激酶的激活与70%甲状腺癌有关，并且滤泡状腺癌、甲状腺腺瘤与RAS基因突变有关，而甲状腺乳头状癌（PTC）与BRAF基因突变和染色体重组致癌基因融合有关，并且散发性成年人PTC具有较高的BRAF基因突变率，尤其是BRAF T1799A突变热点[2]。一般来说，在甲状腺单发结节患者中，恶性结节所占比例较低，约为5%～8%左右，所以大部分甲状腺结节不需要行手术治疗，当前在鉴别诊断甲状腺良、恶性结节时，甲状腺FNA细胞学检查作为一个金标准，但是在应用的过程中，容易受到诸多因素如采集细胞数等影响，约30%结节无法准确诊断，只有行手术切除活检才可以确诊。因为BRAF基因突变作为PTC比较常见的一个分子遗传学改变，即使是微小的PTC也能检出，而良性病变组织和正常甲状腺组织中不存在这一基因突变，所以对BRAF基因突变进行检测，有助于鉴别和诊断甲状腺良恶性结节。临床研究资料表明，甲状腺乳头状癌的发生和发展作为多步骤、多基因的一个过程，在RET/PTC-RAS-RAF-MARK途径中，基因突变占有较高的比例，约为80%左右，其中BRAF具有较高的基因突变率，为44%，并且有文献报道，BRAF突变型甲状腺乳头状癌具有较强的组织侵袭力，容易对甲状腺周围组织产生浸润，临床分期晚，预后差[3]。在该次研究中，复发组中复发病灶与原发病灶BRAF基因T1799A位点V600E突变率分别为50.00%（11/22）、60.00%（12/20），明显高于对照组的BRAF基因1799A位点V600E突变率为22.73%（5/22），陈小丽等[4]在研究中发现，健康对照组的BRAR基因1799位点V600E突变率为24.00%（6/25），明显低于观察组的65.00%（16/25），这一结果与该次研究报道相符，说明BRAF基因突变是导致甲状腺癌复发的一个重要因素。有研究发现，BRAF基因突变是诱发MAPK信号通路异常激活的一个重要因素，当前发现的BRAF基因突变类型已经超过40种，其中T1799A位点的V600E变异比较常见，但是肿瘤的恶性行为是否与BRAF突变有关，临床上还存在着一定的争议。近年来，Riescoeizaguirre等[5]在研究中发现，碘代谢基因的低表达与BRAF基因突变有关，说明部分分化型甲状腺癌放疗中的“碘抗拒”与BRAF有关。同时，通过将MAPK信号通路激活，BRAF基因V600E点突变的致癌作用较强，能够诱发淋巴结转移、恶变细胞包膜浸润等[6]。而Knauf等[7]在研究中发现，BRAF基因V600E突变的甲状腺乳头状癌患者术后更容易残留癌组织，并且具有较高的风险，与该次研究报道一致。此外，原发灶与复发肿瘤作为单细胞克隆，其分子表型应该相同，但是在研究中发现，甲状腺乳头状癌复发转移灶的受体表型容易发生变异，还需要更深入研究[8-11]。

综上所述，BRAF基因突变与甲状腺癌复发密切相关，并且BRAF基因突变患者术后的复发风险较高]，临床上应该重视基因分型诊断，有助于判断患者预后。

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（收稿日期：2017-03-09）