雷公藤配伍减毒作用的研究

何风雷+陈贵英+彭富全+陈燕勤+郭秋平+莫国强+郭钟慧

[摘要] 目的 观察雷公藤的毒性作用及配伍补肾中药后对其毒性的影响。 方法 根据动物体重，将60只SD大鼠随机分为阴性对照组、雷公藤组、配伍组（雷公藤配伍菟丝子、枸杞子、淫羊藿），每组20只。各组大鼠连续灌胃给药30 d，每天1次，阴性对照组大鼠给予0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液。试验期间，每天观察动物的外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状等，每周测定体重。给药30 d后处死动物，进行血液学、激素水平及病理学等各项检查。 结果 与阴性对照组比较，雷公藤组大鼠体重增长迟缓（P < 0.05），血液学指标白细胞计数（WBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞平均体积（MCV）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、网织红细胞数（RET）、网织红细胞比率（RET%）降低（P < 0.05），中性粒细胞数（NEUT）、中性粒细胞比率（NEUT%）、淋巴细胞比率（LYMPH%）降低（P < 0.05）；性激素检查发现卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（TTE）降低（P < 0.05）；病理组织学检查发现雄性附睾管空虚，管腔缩小，管腔內未见精子或细胞成分。与雷公藤组比较，配伍组动物体重变化无明显差异，动物血液学指标WBC、HGB、RET升高（P < 0.05），激素TTE升高（P < 0.05），附睾病变程度减轻。 结论 在本试验研究条件下，雷公藤具有明显的生殖系统及血液系统毒性作用，配伍菟丝子、枸杞子、淫羊藿可减轻其生殖系统及血液系统的毒性作用，具有明显的配伍减毒作用。

[关键词] 雷公藤；配伍减毒；生殖损伤；血液毒性

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（c）-0010-04

[Abstract] Objective To observe the toxicity effect of Tripterygium wilfordii and the influence on the toxicity after compatibility with Chinese nourishing kidney herbs. Methods Sixty SD rats were randomly divided into negative control group， Tripterygium wilfordii group and compatibility group （Tripterygium wilfordii combined with Cuscuta chinensis， Fructus Lycii and Epimedium davidii） according to the body weight of animals， with 20 rats in each group. All groups were administrated with corresponding drugs by intragastric administration once a day for 30 days， the rats of negative control group were treated with 0.5% sodium carboxyl methyl cellulose （CMC-Na）. During the test， the physical signs， behaviors， gland secretion， respiratory and stool characters of animals were observed every day， and weight was measured every week. After 30 days， the animals were killed for the examination of hematology， hormone levels and pathology. Results Compared with the negative control group， the body weight of Tripterygium wilfordii group was grown slowly （P < 0.05）， the hematological indexes such as white blood cell count （WBC）， hemoglobin （HGB）， mean corpuscular volume （MCV）， mean corpuscular hemoglobin （MCH）， mean corpuscular haemoglobin concentration （MCHC）， reticulocyte count （RET） and RET% were decreased significantly （P < 0.05）， neutrophile granulocyte （NEUT）， NEUT% and the ratio of lymphocyte （LYMPH%） were decreased significantly （P < 0.05）； hormone examination showed that follicle-stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and testosterone （TTE） were decreased （P < 0.05） in the Tripterygium wilfordii group； histopathologic examination showed that the male ductus epididymis was empty， the lumen was narrow， and no sperm or cell components in the lumen were found in the Tripterygium wilfordii group. Compared with Tripterygium wilfordii group， the body weight of compatibility group showed no significant difference， the hematology indexes such as WBC， HGB and RET were increased （P < 0.05）， TTE level was increased （P < 0.05） and the degree of epididymal lesions was reduced in compatibility group. Conclusion Under the experimental conditions， Tripterygium wilfordii has obvious toxic effects on reproductive system and blood system. Compatibility of Cuscuta chinensis， Fructus Lycii and Epimedium davidii can reduce the toxicity of Tripterygium wilfordii on reproductive system and blood system， which has obvious effects of attenuated toxicity by compatibility.

[Key words] Tripterygium wilfordii； Attenuated toxicity by compatibility； Reproductive damage； Hematotoxicity

国家食品药品监督管理总局自2007年来积极采取了多项措施，鼓励或要求对上市后药品开展再评价工作，特别是国务院颁发了《国家药品安全十二五规划》，着重强调了药物再评价。目前复方中药物配伍多以药效的协同增效以及减毒作用为依托。市场常见的治疗关节炎的免疫抑制剂多为雷公藤制剂[1-2]，但是雷公藤在发挥药效的同时，对机体的消化系统及生殖系统会产生毒性作用[3-4]，因此降低其毒性，保证其用药安全具有重要意义。本研究观察了雷公藤的毒性作用，并进行了配伍减毒的研究。

1 材料与方法

1.1 药物

雷公藤木部水提物由广州陈李济药厂有限公司提供（批号：10021）；雷公藤配伍菟丝子、枸杞子、淫羊藿的复方由广州陈李济药厂有限公司提供（批号：TG1081）。

1.2 试验动物

SD大鼠，4～5周龄，SPF级，雌雄各半，体重120～160 g，由广东省医学实验动物中心供给。实验动物合格证号：SCXK（粤）2013-0004；饲养环境：每天12 h照明/12 h黑暗交替，温度（24±2）℃，相对湿度50%～60%。

1.3 试剂

凝血质控（批号：548192）、凝血酶原时间（PT）（批号：545388）、凝血酶时间（TT）（批号：40621）、纤维蛋白原（Fib）（批号：40678）均由美国DADE BEHRING公司提供；血液质控（批号：12280802）、白细胞溶血素（批号：R1025）、白细胞染液（批号：R1056）、血红蛋白（HGB）溶血素（批號：1007）、网织红细胞（RET）试剂盒（批号：ZA1025）均由日本Sysmex公司提供。促性腺激素释放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（TTE）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均由武汉伊莱瑞特生物科技有限公司提供。

1.4 仪器

电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），3-18K高速冷冻离心机（德国Sigma公司），Sysmex2000iv型全自动血液分析仪（日本Sysmex公司），Sysmex CA-510型凝血仪（日本Sysmex公司），RM2235型切片机（德国Leica公司），BX 41、BH-2型生物荧光显微镜（日本 Olympus公司）。

1.5 方法

选取检疫合格的SD大鼠60只，按体重随机分成三组，分别为阴性对照组、雷公藤组和配伍组（雷公藤配伍菟丝子、枸杞子、淫羊藿）。阴性对照组给予0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，雷公藤剂量为0.512 g/kg（按体表面积换算法换算为等效剂量的4倍），菟丝子、枸杞子、淫羊藿配伍剂量为0.648 g/kg（按体表面积换算法换算为等效剂量的4倍）。各组动物的给药体积均为10 mL/kg。每天1次，共给药30 d。给药30 d后处死动物，进行血液学、激素水平及病理学等各项检查。

1.6 观察指标

1.6.1 一般状况及体重测定 试验期间，每天观察动物的外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状等。每周称1次体重，观察雷公藤提取物及配伍药物对大鼠体重变化的影响。

1.6.2 血液学检测 末次给药后，各组大鼠禁食16～20 h，用20%乌来糖0.75 mL/100 g麻醉，腹主动脉取血。凝血功能指标PT、部分凝血激酶时间（APTT）、TT、Fib用0.109 mol/L的枸橼酸钠（和血液的体积比为1∶9）抗凝，3600 r/min（离心半径13.5 cm），20℃离心15 min，用凝血仪测定；白细胞、红细胞和血小板体系相关指标以EDTA抗凝，2000 g离心15 min，取血浆，用全自动血液分析仪测定。

1.6.3 性激素水平检测 采用ELISA试剂盒，按试剂盒说明书操作，分别测定雄性大鼠血清中GnRH、FSH、LH和TTE的含量。

1.6.4 附睾组织病理学检查 将附睾组织用10%中性福尔马林固定，酒精脱水，石蜡包埋，2～3 μm切片，常规苏木素-伊红（HE）染色封片，光学显微镜下检查。

1.7 统计学方法

所有实验数据均采用Graphpad Prism 5软件进行统计处理，所得结果均以均数±标准差（x±s）表示。进行方差分析，如F值有显著性差异，用Dunnett-t检验进行组间比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤提取物及配伍药物连续灌胃给药30 d对大鼠一般状况及体重的影响

灌胃给药30 d后，阴性对照组及各给药组动物未见外观体征、行为活动、腺体分泌、粪便性状、呼吸等异常变化。与阴性对照组比较，雷公藤组大鼠体重增长迟缓（P < 0.05），配伍组动物体重明显增加，与阴性对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 雷公藤提取物及配伍药物连续灌胃给药30 d对大鼠血液学指标的影响

灌胃给药30 d后，与阴性对照组比较，雷公藤组大鼠白细胞计数（WBC）、HGB、红细胞平均体积（MCV）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、RET、网织红细胞比率（RET%）降低（P < 0.05），中性粒细胞数（NEUT）、中性粒细胞比率（NEUT%）、淋巴细胞比率（LYMPH%）降低；与雷公藤组比较，配伍组大鼠WBC、HGB、RET升高（P < 0.05），其余指标未见明显差异（P > 0.05）。见表2。

2.3 雷公藤提取物及配伍药物连续灌胃给药30 d对雄性大鼠生殖系统的影响

灌胃给药30 d后，与阴性对照组比较，雷公藤组大鼠出现附睾管空虚、管腔缩小、管腔内未见精子或细胞成分；与雷公藤组比较，配伍组大鼠附睾病变程度减轻。见图1～2。

2.4 雷公藤提取物及配伍药物连续灌胃给药30 d对雄性大鼠性激素水平的影响

灌胃给药30 d后，与阴性对照组比较，雷公藤组大鼠血清中FSH、LH和TTE明显降低（P < 0.05）。与雷公藤组比较，配伍组大鼠激素TTE明显升高（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

雷公藤及其配伍菟丝子、枸杞和淫羊藿的复方是广州陈李济药厂有限公司提供的受试药物，参考我国《药物非临床研究质量管理规范》和委托方提供的与受试物相关的信息和相关文献资料，在GLP条件下，本研究进行了雷公藤及其配伍补肾中药的毒性作用研究，旨在观察连续30 d给予药物对大鼠产生的毒性反应及严重程度，以及配伍能否降低其毒性，为临床设计人用安全剂量和主要监测指标提供参考，也为药物二次开发及多次给药进行风险评价。雷公藤及其制剂的毒性反应主要表现为对消化系统、血液系统和生殖系统的损害[5-7]，本研究主要从血液系统和生殖系统毒性入手，考察配伍补肾中药能否减轻其毒性。

雷公藤对血液系统的毒性反应主要表现为白细胞、红细胞、血小板减少，以粒细胞减少最为常见[8-10]。研究发现，连续4周给予雷公藤提取物后，大鼠的WBC、HGB都有降低[11]。本研究中，血液学指标的结果发现，配伍补肾药物组大鼠的HGB、RET和WBC增多，表明配伍补肾药物可从一定程度上减轻雷公藤对血液系统的毒性。

据报道，雷公藤对生殖系统的毒性反应最为严重[12-14]。雷公藤对雄性动物的毒性反应主要表现为附睾尾内未成熟精子率及畸形精子率升高，睾丸和附睾发生明显的病理变化；雌性动物则表现为动情周期紊乱，卵巢和子宫发生明显的病理变化[15]。本研究中，病理研究发现，雷公藤组雌性大鼠卵母细胞发育异常，卵巢闭锁卵泡数量增加，各级卵母细胞均见减少，黄体数量亦减少，雄性大鼠附睾管空虚，管腔缩小，管腔内未见精子或細胞成分；而配伍补肾中药组雄性大鼠可见附睾病变程度减轻。激素水平的结果也发现，雷公藤组雄性大鼠FSH、LH、TTE降低；配伍补肾药物后，雄性动物的TTE水平升高。这些结果提示配伍补肾药物可减轻雷公藤对生殖系统的毒性。

中药配伍是降低有毒中药毒性的主要途径之一[16-18]。有研究用补肾中药六味地黄丸干预雷公藤多苷导致的雄性幼鼠生殖损伤，结果表明，补肾中药组睾丸病理改变较雷公藤多苷组为轻，提示补肾中药可以降低雷公藤对生殖系统的毒性反应[19]。补肾中药也能减轻雷公藤多苷对雌性幼鼠生殖能力的损伤[20]。本研究将雷公藤与菟丝子、枸杞和淫羊藿配伍，观察其对大鼠生殖毒性相关指标的影响。结果显示，雷公藤配伍上述中药后，动物体重、附睾的病理改变均得到不同程度的缓解，其机制可能与降低FSH、LH和T的分泌有关。

总之，在本研究条件下，雷公藤具有明显的生殖系统及血液系统的毒性作用。配伍菟丝子、枸杞子、淫羊藿可减轻其对生殖系统及血液系统的毒性作用，具有明显的配伍减毒作用。

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