红藻氨酸致癫痫大鼠腺苷酸激酶2表达变化的研究

王晶+殷亮++++++吕涌涛++++++冯肖亚

[摘要] 目的 研究红藻氨酸（KA）致大鼠颞叶癫痫（TLE）后腺苷酸激酶2（AK2）的表达变化，探讨AK2参与颞叶癫痫的发病机制。 方法 将60只雄性SD大鼠分为正常组（10只）和模型组（50只），模型组建立TLE模型；按致痫后6 h、12 h、1 d、3 d、1周对模型组再次进行分组，每组各10只。利用半定量RT-PCR法及Western bloting技术检测AK2 mRNA及蛋白在大鼠额叶及海马中的表达变化。 结果 致痫后额叶及海马组织中AK2 mRNA及蛋白表达均较正常组明显升高（P < 0.05）；致痫后3 d组AK2 mRNA及蛋白含量达到高峰，致痫后1周逐渐降低（P < 0.05）。 结论 AK2可能参与癫痫的发生机制，为癫痫发病机制提供新的依据。

[关键词] 红藻氨酸；癫痫；腺苷酸激酶2；线粒体；凋亡

[中图分类号] R742.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（c）-0014-04

[Abstract] Objective To determine the expression levels of multifunction cytokine AK2 in kainic acid-induced epileptic rat， and to investigate whether AK2 participates in the pathogenesis of EP. Methods 60 male SD rats were divided into control group （10 cases） and model group （50 cases）， the animal model of temporal lobe epilepsy was established in model group by intra cerebroventricular injection of KA. Then the rats in the model group were divided into 6 hours group， 12 hours group， 1 day group， 3 days group and 1 week group， with 10 cases in each group， according to the different time points after seizures. AK2 mRNA and protein expression in frontal lobe and hippocampus tissue were measured by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting. Results In the model group， expression levels of AK2 in both front al lobe and hippocampus tissue were significant increased compared with the control group （P < 0.05）. And the expression levels were reached the highest 3 days after seizures and then gradually declined 1 week later （P < 0.05）. Conclusion AK2 may participate in the pathophysiological process of EP and provide a new mechanistic basis for the pathogenesis of epilepsy.

[Key words] Kainic acid； Epilepsy； Adenylate kinase 2； Mitochondria； Apoptosis

癫痫是大脑神经元过度超同步化异常放电的慢性脑部疾病。其具有多样性的发作形式和复杂的遗传机制，目前对癫痫的发作机制认识还比较局限[1]。有研究发现腺苷酸激酶2（AK2）存在于细胞的线粒体内膜间隙中，线粒体在细胞的调亡过程中起着主要调控作用，表明脑内线粒体的功能障碍在癫痫的发病机制中起着重要作用[2-3]。本实验在立体定向技术下在大鼠行侧脑室注射红藻氨酸建立TLE模型，通过行为学观察癫痫发作后，大鼠额叶及海马组织中的AK2 mRNA及蛋白在不同时间点的表达变化，以探讨AK2是否参与癫痫发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD健康大鼠60只，体重200～280 g，购自山东大学动物实验中心，动物合格证号：0029760。饲养环境标准如下：24 h昼夜循环，恒温23～25℃，恒湿50%～60%，避免噪音及强光照射、每只大鼠分装于独笼，在均可自由进食及饮水的条件下饲养。

1.2 分组

按随机数字表法将大鼠随机分成正常组（10只）、模型组（50只），按KA首次致痫后6 h、12 h、1 d、3 d、1周共5个时间段将模型组分为5组，每组各10只。

1.3 实验方法

1.3.1 制作TLE模型 3.6%水合氯醛360 mg/kg对大鼠进行腹腔麻醉，使用立体定位仪将大鼠固定，备皮，消毒，铺孔巾，沿头部正中线切开皮肤，长度约1 cm，暴露前囟。按前囟后0.8 mm，右侧旁开1.5 mm定位侧脑室，电钻钻孔达硬脑膜表面，将KA（浓度为1 μg/μL）通过微量进样器沿钻孔进针4.5 mm，10 min内推注1 μL，缓慢拔除穿刺針。用消毒骨蜡封闭穿刺处后进行皮肤缝合，对每只大鼠均进行持续行为学观察。按Racine分级标准（1972年）分为0～V级，Ⅲ级以上为成功造模。按上述方法对正常组大鼠进行麻醉后侧脑室注射生理盐水1 μL。

1.3.2 获取脑组织 断头处死大鼠，于冰台上迅速剥取出脑组织，分离出额叶及海马组织，迅速置入冻存管中并于液氮中冻存。

1.3.3 半定量RT-PCR法 RNA 抽提：取约100 mg组织放于研磨器内，边研磨边加入液氮，将组织研磨成粉末状，加入含有Trizol溶液的EP管中，在超声破碎仪中给予充分混匀，置于冰上10 min。加入氯仿，用力充分混匀，置于冰上10 min。离心15 min，10 000 r/min。等体积异丙醇与上层水相混匀后置于-20℃冰箱中10 min，待能看见清楚分层后，离心10 min，10 000 r/min。留取白色沉淀，振荡洗涤RNA，离心5 min，12 000 r/min。弃上清液，4℃冰箱内适度干燥RNA。通过检测波长260 nm和280 nm的吸光度（OD）值，部分RNA进行完整性电泳。

AMV一步法RT-PCR检测：以总RNA为模板逆转录得到cDNA。根据Primer 5.0软件设计AK2引物序列，并已通过碱基局部对准检索工具检测：上游引物5′-GAAGGGGTTAGGGAACAAGC-3，下游引物5′-ATGGCAGCATTTGGTCAGTT-3′。β-actin 上游引物5′-AGATGACCCAGATCATGTTTGA-3′，下游引物5′-TTGGCATAGAGGTCTTTA-3′。反应条件：预变性90℃ 3 min，变性92℃ 30 s，退火60℃ 45 s，延伸80℃ 1 min，最后一次延伸75℃ 5 min，重复2～4次，共28个循环。

电泳：PCR产物进行电泳，通过凝胶图象处理系统进行分析，计算出待测基因与β-actin OD比值作为待测基因mRNA的相对表达量，与正常组进行组间比较。

1.3.4 免疫印迹法 总蛋白的提取：取100 mg组织在含有液氮的研磨器中进行研磨，研碎至粉末状后转入干燥清洁EP管中，进行裂解粉碎后，离心30 min，10 000 r/min，将上清取出分装于EP管中，冻存条件-80℃。

测定蛋白含量：按BCA试剂盒说明进行。

凝胶电泳：取总蛋白50 μg进行电泳。

转膜：正确切割胶条后于转膜缓冲液中进行平衡，按从下至上的顺序：阳极碳板、2层滤纸、PVDF膜、凝胶、2层滤纸、阴极碳板，装好转膜装置，并排空每层气泡后进行转膜。

免疫反应：转膜后于脱色摇床上封闭1 h，加入AK2多克隆抗体（1∶500）进行杂交过夜，待洗膜后用HRP标记的二抗进行杂交。杂交后用再次洗膜。

显影及定影：采用ECL化学发光法进行显色。

凝胶图象分析：用凝胶图象系统处理，计算出待测蛋白与GAPDH蛋白OD比值作为待测蛋白的相对表达量，与正常组进行组间比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察

通过立体定位仪对大鼠进行侧脑室注入KA后，10～30 min绝大部分大鼠癫痫发作，表现：如面部抽搐、节律性点头动作、胡须抖动、肢体阵挛发作；1～3 h后出现癫痫持续状态表现：反复出现双侧眼球凝视，伴咀嚼动作、口角流涎、面部抽搐及肢体阵挛、身体弓背向上、尾部向上高高翘起、反复出现站立跌倒等；6～8 h后癫痫发作频次较前逐渐减少，持续时间较前缩短，1 d～1周后可出现间断性癫痫发作。所有大鼠造模后分级（按Racine分级标准）：0级0只，Ⅰ级0只，Ⅱ级0只，Ⅲ级20只，Ⅳ级19只，Ⅴ级11只，均造模成功，且符合TLE模型标准。但术后出现5只大鼠全身强直阵挛发作，最终无法耐受最终死亡，其中包括Ⅴ级3只，Ⅳ级2只，再次按同样方法造模成功5只大鼠，符合造模入选标准，且无死亡。生理盐水组无上述异常，无死亡。

2.2 模型组大鼠额叶及海马AK2 mRNA的表达

模型组大鼠额叶及海马组织中AK2 mRNA的表达趋势：从致痫后6 h开始逐步增高，3 d后可达高峰，1周后逐渐降低。模型组与正常组相比，额叶及海马组织中AK2 mRNA在不同时间段的表达均显著高于正常组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。各组大鼠额叶及海马AK2 mRNA结果见图1。

2.3 模型组大鼠额叶及海马AK2蛋白的表达

模型组大鼠额叶及海马组织中AK2蛋白的表达趋势：从致痫后6 h开始逐步增高，3 d后可达高峰，1周后逐渐降低。模型组与正常组相比，额叶及海马组织中AK2 mRNA在不同时间段的表达均显著高于正常组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。各组大鼠额叶及海马AK2蛋白表达结果见图2。

3 讨论

癫痫的脑神经元高度同步化异常放电引起不同程度的神经功能障碍，具有刻板性、重复性、发作性[4]。额叶作为大脑发育中最高级的部分，包括初级运动区、前运动区和前额叶，主要功能与精神、语言和随意运动有关。海马主要与记忆以及空间定位有关[5]。既往实验研究中显示癫痫发作中凋亡相关基因大量表达，如P53等，引起神经元大量坏死、凋亡，导致神经元间重组细胞之间的突触联系[6-7]。目前提出凋亡途径主要为：外源性途径/死亡受体途径和内源性途径/线粒体途径。线粒体作为分子靶点或整合元件参与细胞凋亡，在细胞凋亡过程中起着重要作用，是启动细胞调亡的关键之一[8-9]。

AK是广泛存在于动物体内细胞的单体酶，在维持细胞能量平衡起着主要作用，共有5种同工酶，AK2是一种线粒体蛋白，广泛表达于细胞线粒体内膜间隙，并且参与细胞内AMP转化为ADP的过程，影响ADP、ATP、dATP的生成水平，与核苷酸还原酶相关，在细胞凋亡过程中释放到胞浆外[10-11]。在脑内ATP和GTP是脑细胞能量的主要来源，AK2作为一种嘌呤类神经递质或调质存在，也作为营养因子调节神经系统的发育、增殖、凋亡及重塑[12-13]。细胞凋亡是多种细胞共同调控的为维持内环境稳定的细胞死亡过程，癫痫发作后脑内神经元细胞可发生明显的坏死和凋亡，细胞调亡需要耗能，若线粒体轻度受损，所产生的ATP足够维持凋亡所需的能量，神经元最终损伤后调亡；若线粒体受损严重，在缺乏ATP的情况下，神經元则无法启动凋亡程序，最终发生坏死[14-15]。因此，癫痫发病机制中，因损伤的程度和细胞的能量状态不同，凋亡和坏死的形态学特征可同时存在。近年来有研究表明AK2的酶活变化在细胞凋亡过程中起着重要作用，可能参与癫痫的发病机制[16]。

AK2作為一种神经递质或调质，主要参与诱导神经元细胞坏死、凋亡，导致脑内异常放电，引起癫痫发作；还是在癫痫发作过程中，仅因线粒体功能障碍而引起其表达增高；以上问题仍需更多的实验研究进一步研究证实。目前尚无AK2在致痫大鼠脑组织中的表达的实验研究，本实验结果表明，AK2从致痫后在额叶及海马组织中表达即开始出现增高，3 d后达高峰，持续1周后开始缓慢下降，推测线粒体功能受损后AK2大量表达，介导脑内神经元细胞的凋亡过程，引起癫痫发作；癫痫的发作后出现线粒体功能障碍和超微结构改变，增加AK2在细胞胞浆中的表达，两者相辅相承。脑内神经元细胞中的线粒体主要作用于ATP的合成，部分线粒体呼吸酶抑制也可引起癫痫的发作，其功能受到损伤后大量释放AK2，AK2可作为RNA结合的非酶活性蛋白，在胞浆中与相应RNA结合后调节细胞凋亡转录过程，介导细胞凋亡的发生[17-18]。细胞内保持充足的ATP方能维持神经细胞的膜电位的稳定，AK2还可以通过引起ATP水平的下降及神经元Ca2+的动态失衡，影响神经元的兴奋性和突触传递，诱发癫痫发作[19-20]。这将为抑制癫痫发作的新治疗途径提供理论依据。

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