一株干酪乳杆菌生物学特性及其发酵豆乳的研究

陈佩，党辉，贺国旗，王红丽，孟科，陈卫

（1.陕西广播电视大学，陕西西安710119；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723001；3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；4.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119）

一株干酪乳杆菌生物学特性及其发酵豆乳的研究

陈佩1，2，党辉3，4，贺国旗1，王红丽1，孟科1，陈卫3

（1.陕西广播电视大学，陕西西安710119；2.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723001；3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；4.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710119）

主要研究一株具有降糖作用的干酪乳杆菌的生物学特性及其对发酵豆乳的品质影响。结果表明该菌株在强酸条件下可以生长，对人工胃肠液都具有很好的耐受性。耐受胆盐的延迟时间为1.01 h，对Caco-2细胞具有较强的黏附能力(15个/cell)。以干酪乳杆菌发酵豆乳具有良好的品质，且感官评定综合得分为90分。

干酪乳杆菌；发酵豆乳；生物学特性

我国糖尿病患者人数在过去30年中快速增长了近10倍[1]，目前已超过1亿，成为全球糖尿病人数第一大国。因此，对糖尿病的预防和治疗有非常迫切的需求。大多数的糖尿病患者通过药物能达到降糖的效果，但是每种药物都存在有一定的副作用，在使用过程中会对人体健康产生危害。所以人们将目光投向更天然、更安全的降糖途径。近年来，乳酸菌被证实具有预防和治疗糖尿病的作用。有研究发现干酪乳杆菌[2]、VSL#3（双歧杆菌，唾液链球菌，乳酸杆菌）[3]、嗜酸乳杆菌[4]、乳酸杆菌代田株[5]、鼠李糖乳杆菌和双歧杆菌[6]等菌株在动物模型或临床试验中对糖尿病具有预防或治疗的作用。

豆乳含有丰富的植物蛋白、不饱和脂肪酸和维生素等功能成分，不含胆固醇，其营养价值非常高。豆乳经过乳酸菌发酵后制成酸豆乳，产品中含有乳酸菌活菌体及其代谢产物，对人体的肠胃吸收功能有良好的生理作用，同时改善了豆乳原有的豆腥味和组织状态[7]。目前越来越多的研究集中于用乳酸菌发酵豆乳[8-9]，且乳酸菌发酵豆乳制品已成为发展豆乳工业的方向之一。

在前期研究的基础上[10]，研究一株干酪乳杆菌的生物学特性，初步探讨其在豆乳中的发酵特性，为降糖产品的研究开发和规模化生产提供一定的技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干酪乳杆菌CCFM0412：江南大学食品生物与技术中心菌株保藏库；MRS液体培养基：青岛海博；大豆：市售；胃蛋白酶(1∶10 000)、胰蛋白酶（1∶250）、巯基乙酸钠：美国sigma；人结肠癌腺细胞系Caco-2细胞株：上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM高糖培养基、0.25%胰酶、胎牛血清、双抗（青、链霉素）：美国Gibico。

DHP9012恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1CV超净台：苏州安泰空气技术有限公司；320-S pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；UV-2100紫外可见分光光度计：尤尼科上海有限公司；DJ13B-N620SG九阳豆浆机：济南九阳电器有限公司；TA-XT2质构测试仪：英国Godal ming UK；NDJ/79型粘度仪：同济大学机电厂；5415R冷冻离心机：德国Eppendorf；CX41-12C02 倒置显微镜：日本 Olympus；细胞培养瓶：美国Corning。

1.2 方法

1.2.1 干酪乳杆菌的制备

将冻存于-80℃的干酪乳杆菌接入MRS液体培养基中，37℃培养18h，连续活化三代后用于后续试验。

1.2.2 干酪乳杆菌在人工模拟胃肠液中的生长测定

将胃蛋白酶溶于PBS（pH 3.0）中，使其终浓度为3 g/L，过0.22 μm滤膜除菌后备用。将胰蛋白酶溶于PBS（pH 8.0）中，使其终浓度为 1 g/L，过 0.22 μm 滤膜后制备成模拟肠液[11]。

干酪乳杆菌以0.85%生理盐水重悬后，在模拟胃液(pH 3.0)中调节菌液密度至1×109CFU/mL，混匀后37℃培养1、2、3 h检测活菌数。在模拟胃液（pH 3.0）中培养3 h后，取培养液1 mL加入至9 mL的模拟肠液（pH8.0）中，混匀后 37℃培养 2、4、8h检测活菌数[12]。乳酸菌的存活率用以下公式计算：

式中：N1为经过模拟胃肠液处理之后的乳酸菌活菌数；N0为未处理前乳酸菌的活菌数。

1.2.3 干酪乳杆菌对胆盐的耐受能力

取对数生长期的干酪乳杆菌，以2%的接种量分别接种于含有或不含0.3%胆盐的MRS-THIO(MRS含有0.2%的巯基乙酸钠)培养基中，混匀后37℃培养。记录不加胆盐和加了胆盐的培养基吸光值达到0.3个单位时各组所需的时间，这两组的时间差即为干酪乳杆菌在胆盐中生长的延迟时间（Lag Time，LT）。延迟时间的长短，反映了乳酸菌对胆盐的耐受能力。延迟时间越短，说明耐受胆盐的能力越强，反之则耐受胆盐的能力越弱[13]。

1.2.4 干酪乳杆菌对Caco-2细胞的粘附能力测定

Caco-2细胞生长在含有20%胎牛血清，1%L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸和1%双抗的高糖DMEM完全培养基中，于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，隔天换液，等细胞增殖融合率达到80%左右时，以含0.22%EDTA的0.25%胰酶消化细胞，按照1∶3进行传代。取对数生长期的细胞进行下步试验。

参照Bustos等[14]的方法有所改动，调节Caco-2细胞密度为4×104cell/孔接种到6孔板中，37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h。将培养至对数期的干酪乳杆菌离心后用PBS（pH 7.2）冲洗3次后重悬于高糖DMEM完全培养基中，并调整菌液浓度为1×108CFU/mL，加入到已生长好的Caco-2细胞单层中，37℃，5%CO2的培养箱中培养2 h。再以PBS（pH 7.2）冲洗细胞单层3次，用甲醇固定30 min后，再进行革兰氏染色。随机找20个视野数100个细胞，以平均每个细胞上粘附的干酪乳杆菌数来评价其粘附能力。

1.2.5 发酵豆乳的工艺流程[15]

大豆→热烫灭酶（4 min）→浸泡（0.5%NaHCO3溶液，12 h）→清洗→去皮（豆水比1：7，质量比）→热水磨浆（80℃）→过滤→调浆（7%蔗糖）→均质→杀菌（121℃，15 min）→接种→发酵→低温后熟→酸豆乳

1.2.6 接种量对发酵豆乳的影响

取对数生长期的干酪乳杆菌按照3%、5%和7%的接种量接种到豆乳中，37℃培养，记录凝乳时间，测定pH值、滴定酸度和活菌数。

1.2.7 发酵豆乳黏度的测定

在25℃下，利用黏度计（10×转子）测定发酵豆乳的黏度，重复试验3次取平均值。

1.2.8 发酵豆乳游离氨基酸的测定

邻苯二甲醛（ortho-phthalalolehy de，OPA）法测定发酵豆乳的蛋白水解程度。340 nm下测定游离氨基酸与OPA反应形成的复合物的吸光值表示发酵豆乳的蛋白水解程度，以空白作对照[16]。

1.2.9 发酵豆乳感官评价

感官评定小组由10名研究生（5男5女）志愿者组合，并全部接受过《食品感官评定》课程的培训。按照表1各项指标进行评价[17]。

表1 酸豆乳感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented soymilk

2 结果与讨论

2.1 干酪乳杆菌在人工模拟胃肠液中的存活率

乳酸菌要进入人体肠道发挥益生作用，首先应该具有较强的耐受胃肠液的能力。干酪乳杆菌在人工模拟胃肠液中的存活率见表2。

表2 干酪乳杆菌在人工模拟胃肠液中的存活率Table 2 Tolerance of Lactobacillus casei to simulated gastrointestinal juice

从表2可见，干酪乳杆菌在人工模拟胃液（pH 3.0）中可存活3 h，并且存活率为82.34%。在模拟肠液（pH 8.0）中可存活8 h，且存活率可达到90%以上，结果表明干酪乳杆菌对人工模拟胃肠液有很好的耐受力。

2.2 干酪乳杆菌对胆盐的耐受能力

胆盐能够破坏细胞的细胞膜，所以对胆盐的耐受能力是评价益生菌的一个重要指标。干酪乳杆菌对胆盐的耐受能力见图1。

图1中所示，本试验中的干酪乳杆菌对于胆盐的延迟时间为1.01 h，说明此菌株对胆盐具有很好的耐受性。乳酸菌中有些菌株可以产出胆盐水解酶，此酶可将甘氨酸和牛磺酸结合的胆盐催化水解为氨基酸残基和游离的胆盐。这种乳酸菌具有降低血清胆固醇水平和预防正常人高胆固醇血症的发生[18]。

图1 干酪乳杆菌对胆盐的耐受能力Fig.1 Bile salts tolerance of Lactobacillus casei

2.3 干酪乳杆菌对Caco-2细胞的黏附能力

益生菌能够黏附定植与肠壁细胞表面，是其发挥益生作用的必要条件之一[19]。Caco-2细胞是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，可以较好的模拟人体肠道中的环境。干酪乳杆菌对Caco-2细胞的黏附能力见图2。

图2 干酪乳杆菌对Caco-2细胞的黏附形态（×400）Fig.2 The morphology of adherent of Lactobacillus casei to Caco-2 cells

如图2所示，干酪乳杆菌对Caco-2细胞具有一定的黏附能力，依据试验统计结果表明粘附率为15个/cell，由此推测此试验菌株在肠道中具有较好的定植能力，可以发挥其益生作用。

2.4 不同接种量对发酵豆乳的影响

根据发酵豆乳的工艺流程，将干酪乳杆菌以不同接种量接入到豆乳中，测定其凝乳时间、pH值、滴定酸度和活菌数，结果见表3。不同接种量下，酸豆乳的凝乳时间和滴定酸度差异显著（P＜0.05），随着接菌量的增加，豆乳的凝乳时间相应缩短，滴定酸度升高。接种量为7%和3%的pH值差异显著（P＜0.05）。活菌数随着接种量的增加而增加。综合考虑选取7%的接菌量进行后续试验。

表3 干酪乳杆菌接种量对酸豆乳发酵特性的影响Table 3 The fermentation characteristics of Lactobacillus casei in different inoculums densities

2.5 发酵豆乳表观黏度的变化

干酪乳杆菌在发酵豆乳期间表观黏度的变化如图3所示。

图3 干酪乳杆菌发酵过程中酸豆乳表观黏度变化Fig.3 Changes of apparent viscosity of soymilk during fermentation with Lactobacillus casei

发酵前2 h因为豆乳呈液态状，所以表观黏度的变化很微小。之后随着乳酸菌的快速繁殖产酸，豆乳的pH值不断下降，大豆球蛋白之间不断聚集凝结，形成了酸凝胶体系，所以酸豆乳的表观黏度也不断升高。当发酵豆乳过程中凝乳的形成抑制了发酵乳杆菌的乳酸代谢，因此到发酵后期，豆乳黏度呈现缓慢上升的趋势。

2.6 发酵豆乳蛋白水解能力的变化

发酵豆乳蛋白水解能力的变化见图4。

图4 干酪乳杆菌发酵过程中游离氨基酸含量的变化Fig.4 Changes of free amino acid content in soymilk during fermentation with Lactobacillus casei

如图4所示，干酪乳杆菌在发酵豆乳初期，由于其生长代谢缓慢分解大豆蛋白的能力较弱，故游离氨基酸的含量较低，随着发酵时间的延长，大豆蛋白被分解的量增加，游离氨基酸的含量也随之迅速增加，吸光值也越来越高。

2.7 发酵豆乳感官评定

干酪乳杆菌发酵豆乳结束后，经过10名专业感官鉴评人员对色泽，气味，滋味和组织状态4个指标的评定，发酵豆乳产品呈现良好的品质，综合得分为90分。目前市场上还没有比较成熟的发酵豆乳产品，因此我们暂时无法对产品进行横向的比较。但是在以后的应用开发研究中，可以根据特别的产品需求有针对性的进行研究。

3 结论

目前，全球的糖尿病发病率和患者总数都呈逐年增加的趋势。因为传统降糖药物的使用会引发一系列的副作用，所以人们逐渐将目光投入到更安全的天然食品，寻求理想的降糖保健食品。国内外的研究表明乳酸菌通过调节宿主肠道菌群达到降糖的作用。本研究对一株具有潜在的降糖作用的干酪乳杆菌生物学特性及其在发酵豆乳中的应用进行了研究。结果表明该菌株具有较好的耐酸、耐胆盐和黏附的生物特性，耐受胆盐的延迟时间为1.01 h，对Caco-2细胞具有较强的黏附能力（15个/cell），并且发酵豆乳成品风味独特，营养丰富，具有较高的感官评定得分。故该菌株可以作为潜在降糖的益生菌，未来可进一步研究开发出具有降糖作用的新型发酵产品，具有良好的开发应用前景。

[1]Wenying Y,Juming L,Jianping W,et al.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].New England Journal of Medicine,2010,362(12)：1090-1101

[2]Matsuzaki T,Yamazaki R,Hashimoto S,et al.Antidiabetic effects of an oral administration of Lactobacillus casei in a non-insulin-dependent diabetes mellitus(NIDDM)model using KK-Ay mice[J].Endocrine Journal,1997,44(44)：357-365

[3]Ma X,Hua J,Li Z.Probiotics improve high fat diet-induced hepatic steatosis and insulin resistance by increasing hepatic NKT cells[J].Journal of hepatology,2008,49(5)：821-830

[4]Ejtahed H S,Mohtadi Nia J,Homayouni Rad A,et al.Probiotic yogurt improves antioxidant status in type 2 diabetic patients[J].Nutrition,2012,28(5)：539-543

[5]Naito E,Yoshida Y,Makino K,et al.Beneficial effect of oral administration of Lactobacillus casei strain Shirota on insulin resistance indiet-induced obesity mice[J].J Appl Microbiol,2011,110(3)：650-657

[6]Laitinen K,Poussa T,Isolauri E.Probiotics and dietary counselling contribute to glucose regulation during and after pregnancy：a randomised controlled trial[J].British Journal of Nutrition,2009,101(11)：1679-1687

[7]于国萍,孟宪金.乳酸菌发酵法水解大豆异黄酮[J].食品科学,2009(17)：217-220

[8]耿永然,李文军,汪建明.乳酸菌发酵豆乳清除DPPH能力的研究[J].Agricultural Science&Technology,2015,16(9)：2036-2039

[9]王丽,董英丽,双全.无糖发酵红豆乳乳酸菌的筛选及驯化[J].食品工业科技,2015(23)：186-189

[10]Chen P,Zhang Q X,Dang H,et al.Antidiabetic effect of Lactobacillus casei CCFM0412 on mice with type 2 diabetes induced by a high-fat diet and streptozotocin[J].Nutrition,2014,30(9)：1061-1068

[11]Bao Y,Zhang Y,Zhang Y,et al.Screening of potential probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from traditional dairy products[J].Food Control 2010,21(5)：695-701

[12]Guo Z,Wang J C,Yuan L Y,et al.In vitro comparison of probiotic properties of Lactobacillus casei Zhang,a potential new probiotic,with selected probiotic strains[J].LWT-Food Science and Technology 2009,42(10)：1640-1646

[13]Hosono A.Bile Tolerance,Taurocholate Deconjugation,and Binding of Cholesterol by Lactobacillus gasseri Strains[J].Journal of Dairy Science,1999,82(2)：243-248

[14]Bustos I,Garciía-Cayuela Ts,Hernaández-Ledesma B,et al.Effect of flavan-3-ols on the adhesion of potential probiotic lactobacilli to intestinal cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(36)：9082-9088

[15]王水泉,包艳,张延超,等.具有潜在益生特性的发酵乳杆菌在豆乳中的发酵特性[J].中国乳品工业,2010(5)：7-12

[16]Nielsen P,Petersen D,Dambmann C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[J].Journal of Food Science,2001,66(5)：642-646

[17]马成杰,杜昭平,华宝珍,等.植物乳杆菌ST-Ⅲ在豆乳中的发酵特性及发酵豆乳的贮藏稳定性[J].食品科学,2013,34(5)：151-155

[18]Liong M T,Shah N P.Bile salt deconjugation and BSH activity of five bifidobacterial strains and their cholesterol co-precipitating properties[J].Food Research International,2005,38(2)：135-142

[19]伊淑帅,王开,齐宇,等.干酪乳杆菌对产肠毒素大肠杆菌粘附Caco-2细胞抑制作用的研究[J].中国预防兽医学报,2015,37(7)：510-513

Study on the Biological Characteristics of Lactobacillus casei and Application in the Fermented Soymilk Produce

CHEN Pei1，2，DANG Hui3，4，HE Guo-qi1，WANG Hong-li1，MENG Ke1，CHEN Wei3
（1.Shaanxi Radio&TV University,Xi'an 710119，Shaanxi，China;2.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001，Shaanxi，China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122，Jiangsu，China;4.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an 710119，Shaanxi，China）

The aim of the present study was to investigate the biological characteristics of a Lactobacillus casei strain with hypoglycemic activity and application in the fermented soymilk produce.The results showed that Lactobacillus casei could grow under strongly acidic conditions,and survive in the simulated gastro-intestinal juice.The bile tolerance of this strain in the form of lag time was 1.01 h.More importantly,it possessed strong adhesive properties to Caco-2 cells （15 bacteria per cell）.The results revealed that Lactobacillus casei grew well in fermented soymilk with good sensory quality.The sensory evaluation score of fermented soymilk produce was 90 points.

Lactobacilus casei；fermented soymilk；biological characteristics

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.005

2016-09-21

陕西省农业科技创新与攻关项目“益生乳酸菌胞外多糖制备及功能研究”（2015NY025）；陕西广播电视大学重点课题“陕南泡菜中优质菌株的筛选及菌群关系研究”（15D-08-A02）

陈佩（1983—），女（汉），讲师，博士，研究方向：食品微生物。