二甲双胍对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠肝脏功能及炎症反应的影响

沈静雪，张亚杰，蔡凤，范德美，刘矩荣，田坚

(1沈阳医学院附属中心医院，沈阳110024；2中国医科大学附属盛京医院)

二甲双胍对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠肝脏功能及炎症反应的影响

沈静雪1，张亚杰2，蔡凤1，范德美1，刘矩荣1，田坚1

(1沈阳医学院附属中心医院，沈阳110024；2中国医科大学附属盛京医院)

目的 探讨二甲双胍对2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝功能及炎症反应的影响。方法 取40只大鼠，随机分为A组(T2DM+NAFLD+二甲双胍组)、B组(T2DM+NAFLD组)、C组(T2DM组)、D组(空白对照组)各10只。A、B组均予以高糖高脂饲料喂养4周制备NAFLD模型，C组予以基础饲料喂养4周，D组仅以基础饲料喂养8周。A、B、C组一次性腹腔注射STZ制备T2DM模型。造模4周后，A组予二甲双胍150 mg/(kg·d)灌胃4周，B、C、D组均予以等量生理盐水灌胃4周。各组干预结束后，麻醉大鼠，腹主动脉穿刺取血，检测血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、肝功能(ALT、AST、GGT)及血清TNF-α、IL-6水平。取肝脏组织，计算肝指数。采用HE染色法观察肝脏组织病理学变化。采用免疫组化法及Western blotting法检测肝脏组织TNF-α、IL-6蛋白表达。结果 ①B、C组TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均高于D组，HDL-C低于D组(P均<0.05或0.01)。A组TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均低于B组，HDL-C高于B组(P均<0.05或0.01)。②B、C组血清TNF-α、IL-6均高于D组，A组血清TNF-α、IL-6水平均低于B组(P均<0.05或0.01)。③B、C组肝指数均高于D组，A组肝指数低于B组(P均<0.01)。④D组肝组织结构完整，肝小叶结构正常。B、C组肝脏组织呈脂肪样变，部分可见小叶内炎性细胞浸润。A组肝脏脂肪变性程度及炎性细胞浸润较B组明显减轻。⑤B、C组肝脏组织中TNF-α、IL-6蛋白表达均高于D组(P均<0.01)，A组肝脏组织中TNF-α、IL-6蛋白表达均低于B组(P均<0.05)。结论 二甲双胍可明显改善T2DM合并NAFLD大鼠的肝脏功能，抑制NAFLD的发生发展；其机制可能为通过降低炎性因子的表达、改善慢性炎症状态，从而发挥肝脏保护作用。

2型糖尿病；二甲双胍；非酒精性脂肪肝；炎症反应；肝脏功能;肿瘤坏死因子α；白细胞介素6

随着生活方式的改变与健康意识的滞后，2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)等慢性病已成为全球最常见的疾病。目前，中国人群中单独患有T2DM或NAFLD的患病率为10%以上，而二者共同存在的患病率则为42.6%[1]，提示二者之间存在密切的关系。随着对T2DM、NAFLD发病机制的深入研究，发现炎症反应在二者共同机制中起着重要的作用。二甲双胍是治疗T2DM的一线用药，通过降低肝糖原的异生、抑制肝糖原的输出，增加骨骼、肌肉等外周组织对葡萄糖的摄取及利用，发挥降糖作用。此外，它还参与脂质代谢，调节脂肪激素及炎性因子在肝脏中的表达。2016年1～10月，我们观察了二甲双胍对合并NAFLD的T2DM大鼠肝功能、炎症反应的影响，探讨二甲双胍对T2DM合并NAFLD的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物与材料 SPF级雄性大鼠40只，5～6周龄，体质量(200±20)g，购自中国医科大学动物实验中心。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)。二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司)。肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、采用ELISA试剂盒测定(北京中杉金桥有限公司)。

1.2 动物分组与模型制备 40只SPF级雄性大鼠适应性喂养1周后，随机分为A组(T2DM+NAFLD+二甲双胍组)、B组(T2DM+NAFLD组)、C组(T2DM组)、D组(空白对照组)，每组10只。A、B组均予以高糖高脂饲料(10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、1%胆酸盐、66.5%基础饲料)喂养4周，制备NAFLD模型。C组予以基础饲料喂养4周。A、B、C组均禁食水12～16 h，一次性腹腔注射0.5%STZ 30 mg/kg制备T2DM模型，1周后尾静脉取血，以血糖≥16.7 mmol/L且稳定2周为T2DM造模成功。D组仅以基础饲料喂养8周。

1.3 干预方法 A组于NAFLD+T2DM造模4周后，予以二甲双胍150 mg/(kg·d)溶于生理盐水灌胃4周。B组于NAFLD+T2DM造模4周后、C组于T2DM造模4周后、D组于基础饲料喂养8周后，均予以等量生理盐水灌胃4周。

1.4 血脂、肝功能指标及血清TNF-α、IL-6检测 各组干预结束后，禁食8 h，以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射法麻醉大鼠，腹主动脉穿刺取血3 mL，检测血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)、肝功能(ALT、AST、GGT)及血清TNF-α、IL-6水平。

1.5 肝指数测算 取材前测量大鼠体质量，取血后取出肝脏组织，称重后用4%多聚甲醛或液氮固定。肝指数=湿肝质量/体质量×100%。

1.6 肝脏组织病理学观察 将肝脏固定后制备石蜡切片，采用HE染色法观察肝脏组织病理学变化。

1.7 肝脏组织TNF-α、IL-6蛋白表达检测 采用免疫组化法及Western blotting法。①免疫组化法：肝组织石蜡切片，按试剂盒说明书染色。②Western blotting法：取肝组织约50 mg置于EP管内，加入500 μL的RIPA裂解液(其中含1%体积的PMSF)，匀浆机匀浆，离心后提取蛋白。BCA法蛋白浓度，上样量约60 μg。配制8%的聚丙酰胺凝胶，煮样后电泳、转膜、封闭(5%脱脂奶粉)；分别加入一抗TNF-α、IL-6于4 ℃过夜，洗膜1 h加入二抗，室温孵育2 h后电化学发光。应用Quantity One软件计算灰度值，以目的蛋白与GAPDH灰度比值表示目的蛋白表达量。

2 结果

2.1 各组血脂、肝功能指标比较 B、C组TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均高于D组，HDL-C低于D组(P<0.05或0.01)。A组TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均低于B组，HDL-C高于B组(P均<0.05或0.01)。B组TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均高于C组，HDL-C低于C组(P均<0.05或0.01)。见表1。

表1 各组血脂、肝功能指标比较

注：与D组比较，*P<0.01，﹟P<0.01；与B组比较，△P<0.01；与C组比较，▲P<0.01。

2.2 各组血清TNF-α、IL-6水平比较 B、C组血清TNF-α、IL-6均高于D组，A组血清TNF-α、IL-6水平均低于B组，B组血清TNF-α、IL-6水平均高于C组(P均<0.05或0.01)。见表2。

2.3 各组肝指数比较 A、B、C、D组肝指数分别为3.90%±0.35%、7.13%±0.47%、8.66%±0.72%、2.39%±0.41%，B、C组肝指数均高于D组，A组肝指数低于B组(P均<0.01)。

表2 各组血清TNF-α、IL-6水平比较

注：与D组比较，*P<0.05，﹟P<0.01；与B组比较，△P<0.01；与C组比较，▲P<0.01。

2.4 各组肝脏组织病理学变化 D组肝组织结构完整，肝小叶结构正常，肝细胞排列成肝索，在中央静脉周围呈放射状分布，细胞呈多边形。B、C组肝细胞体积不同程度增大，脂肪变以大泡性为主，细胞核被挤向一边，部分可见小叶内炎性细胞浸润。A组肝脏脂肪变性程度及炎性细胞浸润较B组明显减轻。

2.5 各组肝脏组织TNF-α、IL-6蛋白表达比较 ①免疫组化染色：D组大鼠肝脏组织中TNF-α、IL-6几乎无表达；A、B、C组大鼠肝脏组织中TNF-α、IL-6均呈阳性表达，主要定位于细胞质中，颜色呈棕黄色。B组肝脏组织中TNF-α、IL-6表达均较A、C组颜色较深，且阳性细胞数量较多。②Western blotting结果：B、C组肝脏组织中TNF-α、IL-6蛋白表达均高于D组(P均<0.01)，A组肝脏组织中TNF-α、IL-6蛋白表达均低于B组(P均<0.05)。见表3、图1。

表3 各组肝脏组织TNF-α、IL-6蛋白表达比较

注：与D组比较，*P<0.01；与B组比较，△P<0.01。

注：1为B组；2为A组；3为C组；4为D组。

图1 各组肝脏组织TNF-α、IL-6蛋白表达情况(Western blotting法)

3 讨论

临床观察发现，2型糖尿病患者常伴发NAFLD，50%～70%的T2DM患者伴有NAFLD， NAFLD人群是T2DM的高风险人群，40%～50%的NAFLD患者伴有不同程度的糖耐量异常，NAFLD患者6年内约20%可发展为糖尿病，提示二者之间有着密切的联系[2,3]。研究[4,5]发现，NAFLD可增加T2DM及其并发症的发生风险。在NAFLD患者中，由于胰岛素抵抗，TG在肝脏的积聚可导致胰岛素抑制肝糖输出的作用减弱，进一步产生高胰岛素血症和血糖升高，导致糖尿病的发生。此外，合并NAFLD的T2DM患者在心脑血管疾病、周围血管疾病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变的患病率均较无NAFLD的T2DM患者升高；同样地，T2DM也是NAFLD发生的独立危险因素，并且能增加NAFLD 患者死亡的风险[6]。本研究发现，B、C组TC、TG、LDL-C、GGT、ALT、AST均高于D组，HDL-C低于D组，B、C组肝指数均高于D组，B、C组肝脏组织呈脂肪样变，提示T2DM、NAFLD均可使肝组织出现肝脏组织病变，可导致肝脏功能受损；B组上述指标的严重程度重于C组，提示当T2DM合并NAFLD时，有更严重的糖脂代谢紊乱、肝功能受损、肝脏脂肪变，存在着更显著的肝脏病变。

目前认为，炎症反应是T2DM与NAFLD共同的发病机制，从而导致临床上两种疾病相互依存。因此，针对慢性炎症反应进行研究，对于探讨T2DM与NAFLD的发病机制具有重要意义。在T2DM和NAFLD的易感人群中，随着营养过剩、体力活动减少等环境因素的作用，先天性免疫系统被激活，巨噬细胞、脂肪细胞等细胞分泌多种炎症因子，如TNF-α、IL-6等。这些炎症因子通过直接或间接影响胰岛素信号传导通路，从而引起胰岛素抵抗。研究发现, 炎症介导胰岛素抵抗的细胞内信号传导通路主要包括NF-κB、NF-κB抑制蛋白、IKK途径(IKK/NF-κB通路)、C-氨基末端激酶(JNK)通路、细胞因子信号转导抑制物(SOCS)通路、蛋白激酶C(PKC)信号通路等，均可通过多种途径刺激多种炎症因子如TNF-α、IL-6等的表达而导致胰岛素抵抗[7～10]。胰岛素抵抗贯穿于T2DM病程的始终，可减弱胰岛素对脂代谢的调节，促使脂肪沉积于肝脏。作为机体发生慢性炎症的早期炎症标志物，TNF-α、IL-6可通过以下作用促进T2DM患者的NAFLD：①通过脂解作用，使游离脂肪酸水平升高；②改变脂因子的生成，使致炎因子增多，而抗炎因子生成减少；③影响胰岛素信号传导系统，促使胰岛素抵抗形成；④造成线粒体功能障碍，诱发氧化应激[11,12]。本研究发现，与D组比较，B组、C组的血清TNF-α、IL-6水平明显增高，肝脏组织TNF-α、IL-6蛋白表达均明显增高，提示T2DM合并NAFLD时存在着慢性炎症反应，与文献报道一致[7,10]。

二甲双胍作为传统的胰岛素增敏剂，在临床上广泛应用。它能促进胰岛素与受体的结合，并通过降低肝糖原的异生、抑制肝糖原的输出，增加骨骼、肌肉等外周组织对葡萄糖的摄取及利用，发挥降糖作用。此外，它还参与脂质代谢，调节脂肪激素及炎性因子在肝脏中的表达。近年研究表明，二甲双胍具有显著的降低血脂、肝脏脂肪及改善肝功能的效果[13]。应用二甲双胍治疗NAFLD的临床报道也显示，患者口服该药物后AST、ALT下降[14]。近年研究发现，二甲双胍具有抗炎作用，其机制可能与下列作用有关[15～17]：①抑制炎症因子的形成：降低血浆纤溶酶原激活物抑制物-1、CRP的水平，减少氧化应激，改善内皮功能，从而延缓动脉粥样硬化的进程。②激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途径：AMPK的激活可通过抑制NF-κβ的抑制蛋白激酶(IKKα和IKKβ)的活性及抑制Iκβα的磷酸化降解作用，减轻脂多糖诱导的NF-κβ活性,抑制转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)，调节TNF-α、IL-1β、IL-6、诱导型一氧化碳合酶(iNOS)、IL-8、IL-12、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核转位而发挥抗炎作用。③改善胰岛素抵抗：胰岛素抵抗参与了糖尿病的慢性炎症过程，二甲双胍除通过降低体质量间接改善胰岛素抵抗外，本身有直接的胰岛素增敏作用。④抗氧化作用：氧化应激可使单核细胞产生的活性氧簇(ROS)增多，促进NF-κβ活性增强。本研究发现，A组肝指数低于B组，肝脏脂肪变性程度和炎性细胞浸润较B组明显减轻，血清及肝脏组织中TNF-α、IL-6蛋白表达均低于B组，提示A组的糖脂代谢、血清TNF-α、IL-6水平及肝脏组织TNF-α、IL-6蛋白表达均显著改善。这表明二甲双胍可能通过抑制炎症因子TNF-α、IL-6，改善高糖高脂大鼠的脂代谢，从而减轻肝脏脂质的浸润，改善肝脏的脂肪变性及病理损伤。

总之，二甲双胍可明显改善T2DM合并NAFLD大鼠的肝脏功能，抑制NAFLD的发生发展，其机制可能为通过降低炎性因子的表达、改善慢性炎症状态。这表明二甲双胍除具有降糖作用外，还具有减轻肝脏的脂质沉积、降低炎症反应的作用，具有一定的肝脏保护作用。

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辽宁省沈阳市科技计划项目(F14-158-9-29)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.010

R575.2；R587.1

A

1002-266X(2017)30-0036-04

2017-01-11)