渤海不同区域沉积物古菌的多样性分析

王炳臣, 郑世玲, 张洪霞, 魏文超, 王欧美, 刘芳华



渤海不同区域沉积物古菌的多样性分析

王炳臣1, 2, 郑世玲1, 张洪霞1, 2, 魏文超1, 2, 王欧美3, 刘芳华1

(1. 中国科学院烟台海岸带研究所, 海岸带生物学与生物资源利用所重点实验室, 山东烟台 264003; 2. 中国科学院大学, 北京 100049; 3. 滨州医学院, 山东烟台 264003)

产甲烷古菌在滨海沉积物碳循环过程中起着重要作用。本研究以渤海不同区域沉积物为研究对象, 通过T-RFLP以及室内富集培养方法, 解析了渤海不同区域沉积物产甲烷菌群落结构差异, 并评估其产甲烷潜力。结果表明, 渤海不同区域沉积物细菌和产甲烷古菌群落结构组成存在差异, 其主要优势产甲烷菌为和, 主要优势细菌为和。渤海不同区域沉积物在实验室培养条件下产甲烷量存在明显差异, 表现为近岸区域沉积物产甲烷量较高。且渤海沉积物具有较高的产甲烷潜力 (乙酸转换率达到46.46 %), 潜在甲烷排放量估计值可达1.74亿t/年。

甲烷; 渤海; 产甲烷菌; 多样性; 产甲烷潜力

温室效应是全球气候变化的重要表现形式之一。甲烷(CH4)是全球第二大温室气体, 其增温潜势是CO2的21倍[1], 对大气增温贡献率为17%, 研究CH4排放对衡量区域内温室气体的排放具有重要意义。全球甲烷排放量大约为每年500t, 其中74%由产甲烷菌产生[2-3]。产甲烷菌广泛分布于海底及淡水沉积物、水稻田、动物胃肠道、地热及地矿等自然环境中[4], 在全球碳循环中起到重要的作用; 其产甲烷途径主要包括: 氢营养型[5], 乙酸营养型以及利用甲基类化合物的甲基途径[6]。目前, 对甲烷排放的相关研究多集中在草原、水稻田、湿地、湖泊、河口等区域[5-10], 对于海洋沉积物的甲烷排放研究也相对较少。

海洋是大气中CH4的自然排放源, 所释放的CH4量为全球总释放量的2%~4%[11], 其中占全球海洋面积16%的河口和近岸地区的释放量约为全球海洋CH4总释放量的75%[12]。通常, 由于河流中含有的高度过饱和CH4[13]被输入近海区域, 且河流向近岸海域输送大量陆源生物质, 为近海CH4产生提供有利环境条件。因此, 海洋不同区域CH4排放量存在差异, 在估算全球海洋释放CH4量时有很大的不确定性。

渤海属于我国内海, 具有半封闭、海床浅等特性, 是重要的自然渔场与资源矿场, 及重要的水上航线, 因此受到很多人为活动的影响[14-19]。此外, 环渤海区域河流较多, 近海区域受河流陆源性物质输入更为突出, 因此, 分析比较渤海近岸区域、离岸区域以及黄渤海交汇区域沉积物产甲烷菌群落结构与产甲烷潜力具有重要的生态意义。

以往研究主要集中于渤海沉积物微生物多样性, 微生物对渤海溢油降解等方面[20-23], 而对于渤海沉积物甲烷排放的相关研究则很少[24]。本研究通过对渤海不同区域产甲烷菌群落结构的分析及不同区域沉积物CH4排放潜力的评估, 有助于认识渤海区域甲烷代谢的微生物学机制, 同时为估算全球海洋CH4释放量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 沉积物样品来源

沉积物样品于2015年8月取自渤海内不同区域, 共12个位点: 黄河口近岸区域(BHB区域); 从渤海湾至辽东湾贯穿渤海区域(M区域), 样点位于渤海内部; 渤海口与黄海交互作用区域(E区域, 图1)。采用抓斗式取样器采集海洋沉积物后, 取0~5 cm表层沉积物样品, 混合均匀后, 一部分保存于4℃, 用于海水富集培养; 另一部分–80℃冷冻保存, 用于沉积物理化性质测定及微生物多样性分析。

1.2 沉积物理化性质的测定

沉积物硝态氮、铵态氮采用2 mol/L KCl(土水比1︰5) 浸提, 用自动分析仪分析 (AutoAnalyzer III, Seal, Germany)分析测定; 硫酸盐 (SO42–) 用去离子水 (土水比1︰10,/) 提取, 用自动分析仪 (Dionex ICS3000, DIONEX, America)测定; pH值采用去离子水 (土水比1︰2.5,/) 浸提15 min后用pH计 (PH-3C, 上海雷磁, 中国)测定。

可提取态Fe(II)浓度的采用紫外菲啰嗪(Ferrozin)显色法测定[25]: 称取0.5 g沉积物加入到4.5 mL的0.5 mol/L盐酸中, 室温条件下黑暗静置24 h。8 000 r/min离心5 min, 取上清0.1 mL, 加入1.9 mL含0.1% 菲啰嗪的200 mmol /LHEPES缓冲液, 反应5 min, 在562 nm波长下测定吸光值, 根据标准曲线计算Fe(II)浓度。每个样品重复3次。

1.3 DNA提取及T-RFLP分析

沉积物样品DNA采用FastDNATMSPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA) 试剂盒提取, 具体操作参照说明书标准流程。参考Zheng等的方法进行T-RFLP分析[26], 以DNA为模版, 细菌引物为 Ba27f/Ba907r, 古菌引物为Ar109f/Ar915r进行PCR扩增。其中引物Ba27f的5′端和Ba907r的3′端标记6-羧基荧光素 (FAM)。PCR反应参数为: 94℃ 2 min预变性; 94℃变性30 s; 温度55℃ 30 s退火; 温度72℃ 1 min延伸, 反应25个循环。PCR产物经纯化后, 古菌DNA采用TaqI酶进行酶切, 细菌DNA采用MspI酶进行酶切, 酶切产物采用自动测序仪ABI PRISM 3730XL分析。

1.4 沉积物富集培养

沉积物富集培养: 采用海水富集培养基 (NH4Cl 1.5g/L, NaH2PO40.6 g/L, NaCl 11.7 g/L, NaHCO32.5 g/L, CaCl2·2H2O 0.1 g/L, KCl 0.1 g/L, MnCl2·4H2O 0.005 g/L, Na2MoO4·2H2O 0.001 g/L, MgCl2·6H2O 0.1 g/L, MgSO4·7H2O 0.1 g/L, CH3COONa 2.7 g/L, 酵母提取物 0.05 g/L)[27], 以33 mmol/L乙酸为电子供体进行富集培养。培养基分装至100 mL的西林瓶中, 每瓶40mL, 充入混合气(N2: CO2, 80 : 20)30 min, 密封。培养基通过高压灭菌锅, 121℃, 0.15 MPa灭菌20 min,冷却至室温后置于厌氧操作台进行接种, 采用无菌注射器向每瓶加入0.5 g沉积物的悬浮液, 并设置无沉积物的纯培养基作为对照, 置于适合产甲烷古菌的30℃黑暗条件, 静置培养。

富集培养期间, 每隔5 d用无菌注射器分别抽取气体和液体样品, 用配备FID检测器的气相色谱 (Agilent 7890A) 测定甲烷产量, 若样品中CH4浓度过高时, 则用N2稀释后测定。甲烷气相色谱检测方法: 用H2、N2和CO2为保护气, 以浓度为400×10–6的甲烷为标气。设置前检测器为250℃, 后检测器为330℃, 设置柱温箱为75℃, 后进样口温度为375℃, 点火完毕后使用FID检测器检测, CH4出峰时间约为1.3 min。用高效液相色谱 (Agilent 1260 Infinity Quaternary LC) 测定乙酸浓度, 用注射器 (无菌) 抽取1 mL液体样品10 000 r/min离心2 min, 取上清稀释, 过0.22mm孔径滤膜后上机检测。

1.5 数据分析

本研究中T-RFs片段所代表的属水平上的细菌或古菌的鉴定参照文献及课题组研究滨海湿地样品所建的细菌和古菌克隆文库[26,28], 并使用Greengene进行BLAST比对。利用软件CANOCO 4.5(蒙特卡洛检验, 基于499个随机非限制排列)进行微生物群落结构与环境因子之间相关性的RDA分析, 以及做微生物群落结构组成的PCA分析。微生物T-RFs片段多样性, 用香农威纳指数(Shannon Wiener, H= –SPilnP式中P=N/,N为种的个体数,为所在群落的所有物种的个体数之和) 计算并表示。采用Sigmaplot 12.5软件对产甲烷和乙酸消耗数据进行分析。通过实验结果, 估算渤海区域产甲烷潜力: 渤海区域产甲烷潜力估算值=渤海区域面积×渤海平均深度×实验室乙酸浓度×实验室中乙酸产甲烷最大转换率。

2 结果与分析

2.1 沉积物的理化性质

如表1所示, 3个区域所有站位沉积物pH值均呈碱性 (7.5~9.0)。BHB区域样品的pH相对较低; M区域各位点样品pH (8.5~8.7) 略高, 且相对稳定; 导电率相对较高; E区域位点样品pH值介于7.5~9.0, 变化相对较大; 电导率相对较低, 而铵态氮含量相对较高, 硝态氮含量较低。

2.2 渤海沉积物微生物多样性

如图2所示, 渤海不同区域沉积物优势古菌T-RFs片段均为86、181和388 bp。此外, E区域站位样品古菌T-RFs片段还包括197、221 bp; 而M区域各位点样品古菌T-RFs片段还包括197 bp和304 bp。说明渤海不同区域沉积物样品主要古菌群落相同, 同时存在区域性多样性的差异。

表1 不同站位沉积物理化性质(平均值±标准误差)

参照已建克隆文库, 各T-RFs片段代表的属水平上的古菌见表2。可知, 渤海沉积物共有的优势古菌T-RFs片段86 bp和181 bp分别代表甲烷杆菌属()和甲烷八叠球菌属(), 而其他T-RFs片段代表未知古菌。

由图2 (b)可知, 渤海不同区域沉积物细菌群落结构存在明显差异。细菌T-RFs 片段160、490和505 bp 为渤海不同区域沉积物样品的主要优势片段, 与M区域的主要优势细菌片段相同; E区域样品细菌T-RFs片段还包括91 bp和113 bp; BHB6样品细菌T-RFs片段还包括91、113、128、435和446 bp, 其中BHB区域代表片段多样性的Shannon指数为1.44~2.56, 相比其他区域, 细菌多样性最高。说明结果与古菌相类似, 渤海不同区域沉积物样品存在区域性多样性的差异。

各T-RFs 片段代表的属水平上的细菌见表3。160 bp和490 bpT-RFs 片段分别为脱硫弧菌属()和硫杆菌属 (); 此外, 91, 113, 128和435 bp T-RFs片段分别代表拟杆菌属 (), 脱氯菌属(), 副球菌属()和鞘氨醇单胞菌属 ()。其他T-RFs片段代表细菌未知。

表2 采用限制性内切酶Taq I产生的古菌片段构建克隆文库的16S rRNA基因系统发育关系

注: a为用Greengene进行BLAST比对的结果, b为限制性内切酶I切割后的T-RF片段长度

表3 采用限制性内切酶MspI产生的细菌片段构建克隆文库的16S rRNA基因系统发育关系

注: a为用Greengene进行BLAST比对的结果, b为限制性内切酶I切割后的T-RF片段长度

2.3 渤海沉积物微生物群落结构的主成分分析(PCA)

为了进一步分析渤海不同区域沉积物微生物群落结构组成变化, 对12个位点样品微生物群落结构做主成分分析。结果如图3所示, 除M5与E0聚集在一起外, 其他位点沉积物微生物群落结构具有明显差异。相同区域范围的不同位点样品微生物群落组成也表现出明显差异, 说明渤海不同位点沉积物样品的微生物群落结构存在较大差异, 具有较高的微生物多样性。

2.4 沉积物微生物群落结构与环境因子相关性分析

为了探究影响渤海沉积物微生物群落结构的环境因素, 对渤海沉积物细菌和古菌群落结构与环境因子之间分别做冗余分析(RDA)。结果显示(如图4a), 总铁、Fe(II)、电导率、pH、铵态氮、硫酸盐共6个变量组合, 能够保证所有变量膨胀系数都小于4, 其中硫酸盐解释量最高为15.5%, 总铁解释量最低为9.3%, 4个变量的前两个轴共解释了38.5%的古菌T-RFs片段变化, 约73.1%的群落-环境关系。BHB和E区域样品古菌群落主要受铵态氮影响, 而M区域中M5、M8、M9、M11四个位点样品古菌群落结构主要受硫酸盐和Fe(II)影响。T-RFs 221bp和388bp代表的古菌群落与铵态氮呈正相关; T-RFs 197bp和 304bp代表的古菌群落与pH、EC和Fe(II)呈正相关; 181bpT-RFs与硝态氮和亚硝态氮呈正相关。

散点图是主坐标1 (PC1)与主坐标2 (PC2)。样品的变化百分比如图中所描述的在轴上显示

The scatterplot is of principal coordinate 1 (PC1) as a function of principal coordinate 2 (PC2); The percentage of the variation in the samples described by the plotted PCs is shown on the axes

如图4b所示, 总铁解释量最高为32.4%, pH解释量最低为5.35%, 四个变量的前两个轴共解释了55.5%的细菌T-RFs片段变化, 约92.4%的群落-环境关系。可提取态总铁(TFe)是影响渤海沉积物细菌群落结构的显著环境变量(<0.05)。M1、M9、E2和E4位点细菌群落结构与pH和硫酸盐呈正相关; BHB6、E0和E7位点细菌群落结构与Fe(II)和TFe呈正相关。

2.5 渤海不同区域沉积物产甲烷量的变化

由图5可知, 在整个富集培养期间中 (0~40 d), 对照 (CK) 处理没有CH4产生, 而渤海不同区域沉积物样品产CH4量具有明显差异。在培养的0~15 d, 所有沉积物富集样品中均没有甲烷产生; 在培养的第20天以后, 所有样品开始产生CH4并积累。BHB8样品最先产生CH4且含量迅速上升, 在第25天达到最大值0.62 mmol, 之后保持相对稳定, 其产甲烷速率为1.5 mmol/d; BHB6样品在第25天后甲烷产量迅速上升, 在第35天达到最大值0.58 mmol。E4样品在第25天后甲烷产量也迅速上升, 在第35天达到最大值0.56 mmol; 而E区域中其他样品产甲烷量相对较少。M区域的M1、M8和M11样品在第25天后产CH4量迅速上升, M1在第30 天达到最大值0.59 mmol, 之后保持相对稳定, M8和M11样品在第35天分别达最大值0.60 mmol和0.65 mmol。

在整个培养期间 (0~40 d), 乙酸作为底物被消耗与CH4产量基本相对应。对照 (CK) 处理乙酸含量基本保持33 mmol/L不变。BHB6和BHB8样品乙酸含量在第20天后开始逐渐下降, BHB6在第40天乙酸被全部利用, BHB8的乙酸含量在第40 天下降为13.92 mmol/L。在培养的第30天, E4样品的乙酸就被消耗完, 而E区域其他样品在培养的最后乙酸含量均小幅降低。M1和M11样品的乙酸含量分别在第35、40天降低为0 mmol/L, M区域其他样品在培养的最后乙酸含量也均小幅降低。说明渤海不同区域沉积物样品利用乙酸为底物产CH4的情况不同, 虽然所有沉积物样品具有相同的优势产甲烷菌。E4样品细菌和古菌群落结构及产甲烷量都明显不同于E区域其他样品, 说明渤海沉积物微生物群落结构及功能具有区域特异性。通过由乙酸产甲烷 (CH3COOH→CH4+CO2) 计算发现, 最大转换率为46.46%。

3 讨论

根据底物利用类型, 产甲烷菌可分为3类: (1)乙酸营养型, 如甲烷鬃毛菌属(); (2)氢营养型, 主要利用H2和甲酸作为电子供体还原CO2产生甲烷, 如甲烷杆菌属(); (3)甲基化营养型, 通过H2还原甲基化合物中的甲基产甲烷或通过甲基化合物自身的歧化作用产甲烷, 如产甲烷球菌属()。海洋和滨海湿地盐度和硫酸盐含量较高, 而盐度和硫酸盐影响竞争性电子和产甲烷底物的种类和含量, 对产甲烷菌群落结构和甲烷产生途径有重要影响[29]。3种营养型的产甲烷菌广泛分布于淡水环境、滨海湿地和海洋沉积物中。Liu等[30]研究发现太湖沉积物中优势古菌为Metha­no­microbiales目和Methanosarcinaceae科的产甲烷菌,而闽江河口区短叶茳芏潮汐淡水沼泽湿地土壤主要优势产甲烷菌为、和[9];、和为东海油气田沉积物的主要产甲烷菌。与以往研究类似[33], 本研究中沉积物主要优势古菌为产甲烷菌和, 分别为氢营养型和乙酸营养型[32], 而兼性菌还能够利用甲胺类产甲烷。因此, 渤海沉积物中3种类型有机底物都能够被利用而产生甲烷。

Baldwin等[34]对淡水湿地研究发现, 随着添加盐度的增加, 土壤中产甲烷菌群落多样性降低。Jenifer 等[35]对添加海水的淡水湿地的研究发现, 细菌和古菌的群落结构均没有随着盐度的增加而改变。在渤海沉积物中产甲烷菌群落结构与盐度没有显著相关性, 本研究中也没有发现显著影响海洋沉积物古菌多样性的环境因子, 所以站点与环境因子种类的增加是该区域进一步研究的重点。

本研究中近海沉积物样品产甲烷速率较快, 可能由于海洋沉积物中甲烷的产生速率在很大程度上受限于可降解有机质的含量[36], 而在近海区域受河流携带大量悬浮物和有机物的沉积, 使该海域沉积物中有机碳含量较高, 产甲烷菌活性较强。根据室内富集培养产甲烷量, 本研究对渤海最大产甲烷潜力进行了估算: 渤海平均深度为18 m[37], 总面积为7.7万km2[38], 按照实验室中乙酸浓度 (33 mmol/L) 与转化率 (46.46%) 计算, 整个渤海年甲烷产生潜力约为17.4亿t, 小于很多湿地环境中甲烷产生量[39-41], 可能由于海洋沉积物产甲烷底物含量低且存在更高浓度的产甲烷的竞争电子受体, 如硫酸盐、硝酸盐以及铁锰氧化物[42-44]。但本研究估算值大于李佩佩等的夏季估算值360~930 t[24], 这可能由于渤海海域有机酸输入小于实验输入值, 甲烷氧化与溶解等原因[46]。但同时说明渤海产甲烷潜力巨大 (17.4亿t/年), 随着陆源输入及人为活动的影响, 甲烷排放可能进一步升高。

4 结论

渤海不同区域沉积物细菌和产甲烷古菌群落结构组成存在差异。可提取态总铁对细菌群落结构具有显著影响,和为渤海沉积物主要优势细菌。渤海沉积物主要优势产甲烷菌为和。渤海不同区域沉积物产甲烷量具有明显差异, 表现为近岸区域沉积物产甲烷量较高。且渤海沉积物具有较高的产甲烷潜力 (乙酸转换率达到46.46 %), 潜在甲烷排放量估计值可达1.74 亿t/年。

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Diversity of archaea in the sediments from different areas of the Bohai Sea

WANG Bing-chen1, 2, ZHENG Shi-ling1, ZHANG Hong-xia1, 2, WEI Wen-chao1, 2, WANG Ou-mei3, LIU Fang-hua1

(1. Key Laboratory of Coastal Biology and Biological Resources Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Binzhou Medical University, Yantai 264003, China)

Methanogens play an important role in the carbon cycle of coastal sediments. In this study, sea water enrichment cultures with acetate as the substrate were employed to enrich methanogens using sediments of the Bohai Sea. The methane production was used to estimate potential methane productivity and terminal restriction fragment length polymorphism analysis was used to analyze the diversity of microbial communities simultaneously. Our results revealed that changes in the bacterial and the methanogens community structures in sediments from different areas of the Bohai Sea were found. The dominant methanogens wereandin sediments of the Bohai Sea, andandwere the dominant bacteria. Different areas of the Bohai Sea obviously varied on methane production, which shows that the methane emission is higher in the coastal area. Bohai Sea has great potential for methane productivity and acetic acid conversion rate (46.46%), and the estimation of potential methane production is 1.74 Gt per year.

methane; Bohai Sea; methanogens; diversity; potential methane productivity

(本文编辑: 梁德海)

[National Natural Science Foundation of China, No. 41371257, No.41573071, No.41401285, No.31600370; The Key Program, No. KZZD- EW-14; Hundred Talents Program (A) of the Chinese Academy of Sciences]

Dec. 12, 2016

Q936

A

1000-3096(2017)05-0008-09

10.11759/hykx20161024002

2016-12-12;

2017-02-07

国家自然科学基金面上项目(41371257、41573071)、国家自然科学基金青年项目(41401285、31600370), 中国科学院重点部署项目(KZZD-EW-14); 中国科学院百人计划经费资助项目(A类)

王炳臣(1989-), 男, 河北景县人, 博士研究生, 主要从事渤海沉积物微生物生态研究, 电话: 0535-2109269, E-mail: bcwang@yic.ac.cn;刘芳华, 通信作者, 研究员, 电话: 0535-2109268, E-mail: fhliu@yic.ac.cn; 王欧美, 通信作者, 副教授, 电话: 0535-6913374, E-mail: ziou79@ hotmail.com