气相色谱-质谱法测定酵素产品中短链脂肪酸

庞锦伟，姚欣，雷超，刘锋军

（1.渭南市产品质量监督检验所，陕西渭南714000；2.陕西省发酵产品质量监督检验中心，陕西渭南714000）

气相色谱-质谱法测定酵素产品中短链脂肪酸

庞锦伟1，2，姚欣1，2，雷超1，2，刘锋军1，2

（1.渭南市产品质量监督检验所，陕西渭南714000；2.陕西省发酵产品质量监督检验中心，陕西渭南714000）

建立了用气相色谱-质谱法（GC-MS）测定酵素样品中5种短链脂肪酸（SCFA）的定性定量方法。结果表明，该方法可以有效分离测定酵素样品中5种SCFA，该方法检出限低（0.030～0.100mg/kg），加标回收率80.1%～110.6%，相对标准偏差（RSD）1.36%～10.0%。用该方法分析37种酵素样品中SCFA，结果表明，86.5%的酵素产品检出乙酸（1.02～36.1 g/kg），仅有一种酵素产品检出丁酸（含量为0.056 g/kg），其余均未检出。该方法适用于酵素产品中短链脂肪酸的检测。

短链脂肪酸；酵素；气相色谱-质谱法

短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）通常是指碳链中碳原子数少于6个的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等[1-3]。SCFA是由于饮食中不消化的淀粉、纤维多糖等在结肠腔内经厌氧菌（双歧杆菌、乳杆菌、类杆菌等）酵解生成，其是结肠粘膜的主要能量供应来源，还可以维护肠道上皮细胞的完整性和杯状细胞的分泌功能，同时还具有促进水、钠吸收，刺激结肠上皮细胞增殖和黏膜生长，增加肠系膜血流和胃肠激素分泌等生理作用[4-8]。酵素是以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定活性成分的产品[9]，包括低聚糖、氨基酸、有机酸等营养成分以及具有生物活性的酶（蛋白酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶等）、生物碱等功能性成分，能够有效消除体内自由基，使酵素具有改善人体内微环境、提高免疫力、降低胆固醇等功效[10-19]。酵素流行于日本、中国台湾等地区，近年来作为健康食品在我国逐步流行起来[20]。但由于缺乏相关技术标准和管理规范，导致目前市场鱼龙混杂，部分生产者或销售者在没有检验数据的支持下宣称其产品含有短链脂肪酸，造成消费者的困扰和执法难点，因此测定酵素产品中短链脂肪酸含量对制定产品方法标准、规范市场、加强监管等方面有着重要意义。

本研究建立了气相色谱-质谱联用法（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定酵素产品中乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和戊酸5种短链脂肪酸的定量分析方法，并对37种酵素产品样品的分析。本方法具有简单、快速、准确度高等特点，对酵素产品中短链脂肪酸的检测和标准的制定奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冰乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸（色谱标样）：天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇（色谱级）、其他试剂均为分析纯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

酵素样品由某生产厂商直接提供，共计37个样品。其中固体类酵素样品24个，液体类酵素样品13个；复合原料酵素样品28个，单一原料酵素样品9个。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、VF-WAXms毛细管色谱柱（30m×25mm×0.25μm）、DB-FFAP毛细管色谱柱（30m×25mm×0.25μm）、OV-351毛细管色谱柱（30m× 0.32mm×0.25μm）：美国Agilent公司；VG3S25漩涡振荡器：德国IKA公司；AS20500A超声波清洗器：天津奥特塞恩斯仪器有限公司；GL-20G-II低温高速离心机：上海安亭科学仪器厂；0.22μm针头式过滤器：天津津腾实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取1 g试样（精确至0.01 g）置于50m L聚丙烯离心管中，加入5m L体积比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl），涡旋混匀1m in后500W超声波提取15m in，待溶液冷却后8 000 r/min离心5min（如固体类酵素则12 000 r/min离心8min，重复一次），取上清液通过0.22μm滤膜后上机[21]。

1.3.2 混合标准序列配制

分别称取5种短链脂肪酸标准品（精确至0.1mg）于容量瓶中，加体积比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl）定容至刻线，得到单短链脂肪酸标准储备液，质量浓度分别为乙酸42.0mg/L，丙酸39.7mg/L，丁酸38.3mg/L，异戊酸37.6mg/L，戊酸37.0mg/L。分别移取1.00m L单短链脂肪酸标准储备液至10m L容量瓶中，用体积比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2% HCl）稀释至刻线，得到混合短链脂肪酸标准使用液。再用体积比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl）逐级稀释混合短链脂肪酸标准使用液成混合标准序列溶液。

1.3.3 气质条件

程序升温：初始温度100℃，以5℃/min升至150℃后，升温至240℃并保持3m in；进样口温度：230℃；辅助温度：240℃；四极杆温度：150℃；离子源温度：230℃；进样量：1μL；进样方式：不分流进样；载气：高纯氦气（纯度＞99.999%）；载气流速：2m L/m in。

1.3.4 定性定量分析

用所获得的GC-MS图谱与标准谱图数据库进行对比，将峰相似度＞90%的标本峰以及不同短链脂肪酸的分子离子峰作为选择离子，根据软件确定各离子的丰度和范围。

2 结果与分析

2.1 色谱柱选择试验

综合考虑所测定的5种短链脂肪酸的沸点和极性并结合酵素样品的特性，选择VF-WAXms、DB-FFAP和OV-351三种色谱柱作为候选色谱柱进行分析测定，根据分离效果综合考虑使用VF-WAXms毛细管色谱柱进行酵素产品中5种短链脂肪酸的分析测定[22]。

2.2 方法分离度和线性关系试验

在所采用的仪器条件下，对5种短链脂肪酸的混合标液进行分析测定（见图1），以考察5种SCFA的分离度和线性关系，结果见表1。

图1 5种短链脂肪酸混合标液GC-MS总离子流色谱图Fig.1 Total ions chrom atogram of five SCFAsm ixed standard solution analysis by GC-MS

表1 5种短链脂肪酸的出峰时间和线性关系结果Table 1 Results of peak time and linear relationships of five SCFAs

由图1、表1可知，5种SCFA的出峰顺序依次为：乙酸（3.65min）、丙酸（4.68m in）、丁酸（5.97m in）、异戊酸（6.62min）、戊酸（7.77m in），在所测定的浓度范围内，5种SCFA均具有良好的分离度（分离度＞2）和线性关系（R2＞0.995），5种SCFA的线性范围较宽，均可以达到102。

2.3 方法精密度和检出限试验

在所采用的仪器条件下，对混合标准序列溶液进行重复进样（重复5次），以考察方法的稳定性，并用1∶1（V/V）甲醇-水溶液（含0.2%HCl）逐步稀释混合标准序列溶液直至信噪比（S/N）＜3，以考察方法的检出限，结果见表2。

表2 5种短链脂肪酸的稳定性和检出限结果Table 2 Results of stability and lim its of detection of five SCFAs

由表2可知，在该仪器条件下，5种SCFA出峰时间偏差极小（0.001%～0.132%）、峰面积偏差和峰高偏差均在合理范围内。根据试验结果计算出该方法测定5种SCFA的检出限为0.030～0.100mg/kg，表明该方法检出限，完全能够满足检测要求。

2.4 加标回收率试验

向酵素样品加入不同水平的混合标准溶液（加入量见表3），按照样品处理方法处理后上机，每个浓度水平重复处理5次，以考察方法准确度，结果见表3。

表3 5种短链脂肪酸加标回收率试验结果Table 3 Results of adding standard recovery rate tests of five SCFAs

由表3可知，5种SCFA加标回收率为80.1%～110.6%，相对标准偏差（relativestandard deviation，RSD）为1.36%～10.0%，表明该方法具有良好的准确度，方法可靠。

2.5 稳定性试验

由于溶剂中含有甲醇，可能与标准品或样品中酸类物质酯化反应影响测定结果，因此增加稳定性实验，即在混合标准序列溶液配制后1～24 h使用所用方法分别进样，以考察方法的稳定性。结果表明，随着时间的推移，5中SCFA的标准峰面积呈现先稳定再逐步降低，10 h后出现相应短链脂肪酸酯的峰并逐渐增大，因此综合考虑认为样品处理完成后不易放置超过8 h，同时标准溶液也应现用现配，以免造成较大误差。

2.6 酵素样品中SCFA含量测定试验

用上述方法对35种酵素样品进行了5种SCFA含量测定。结果表明，乙酸是所检酵素样品中短链脂肪酸检出率最高的，86.5%的酵素产品检出乙酸成分，含量范围为1.02～36.1 g/L，均值为7.8g/L。其中固体酵素检出率（61.5%）远低于液体酵素检出率（100%），复合原料酵素检出率（82.1%）远低于单一原料酵素检出率（100%）。剔除未检出的样品，固体酵素乙酸含量（12.21 g/L）远高于液体酵素（6.39 g/L），复合原料酵素乙酸含量（9.13 g/L）约为单一原料酵素乙酸含量（4.55 g/L）的2倍。综合而言，复合原料的固体酵素中乙酸含量多于其他酵素样品。其他SCFA测定结果仅有一种酵素样品检出丁酸，含量为0.056 g/L，其余3种短链脂肪酸均未检出。结合发酵工艺可以认为乙酸是酵素产品中最主要的短链脂肪酸。

3 结论

采用甲醇水溶液超声提取酵素样品中的短链脂肪酸，使用VF-WAXms毛细管色谱柱的GC-MS可以同时分离测定乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸5种SCFA，方法具有分离效果好，线性范围0.037～4.200mg/L、回收率80.1%～110.6%，检出限0.030～0.100mg/kg，稳定性好，操作简便、准确度高等特点，将此方法应用于酵素实际样品的测定，结果86.5%的酵素产品检出乙酸成分（1.02～36.1 g/L），仅有一种酵素样品检出丁酸，其余3种短链脂肪酸均未检出。该方法适用于酵素样品中短链脂肪酸的检测，也为酵素产品检测的标准化奠定了理论和数据基础。

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Determ ination of short-chain fatty acids in fermentsby gaschromatography-massspectrometry

PANG Jinwei1,2,YAO Xin1,2,LEIChao1,2,LIU Fengjun1,2
(1.Weinan Supervision&Inspection Institute ofProductQuality,Weinan 714000,China; 2.ShaanxiProvincialSupervision and Inspection CenterforFermented ProductQuality,Weinan 714000,China)

The qualitative and quantitative analysismethods of 5 kindsof short-chain fatty acids(SCFA)in ferments sampleswere established by gas chromatography-massspectrometry(GC-MS).The resultsshowed that themethod could effectively separate the five kindsof SCFA in fermentssamples,and had low lim itsof detection(0.030-0.100mg/kg),adding standard recovery rate range 80.1%-110.6%,and relative standard deviation(RSD) 1.36%-10.0%.The determination resultsof37 kindsof fermentssamplesanalysisby themethod indicated thatacetic acid was detected in 86.5%fermentssamples(1.02-36.1 g/kg),butyric acid wasdetected in only one sample(0.056 g/kg),and other componentswere notdetected.Therefore,the method could be used fordetermination of five SCFAs in fermentsproducts.

short-chain fatty acids;ferment;gas chromatography-massspectrometry

O657.63

0254-5071（2017）08-0165-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.036

2017-05-26

庞锦伟（1990-），男，助理工程师，硕士，主要从事食品质量检验工作。