固相萃取-气相色谱/质谱法同时测定植物油中胆固醇和维生素E

严婉盈，冼燕萍，林晓佳，王强，郭燕华，李秀英*

（广州质量监督检测研究院，广东广州511400）

固相萃取-气相色谱/质谱法同时测定植物油中胆固醇和维生素E

严婉盈，冼燕萍，林晓佳，王强，郭燕华，李秀英*

（广州质量监督检测研究院，广东广州511400）

建立了固相萃取（SPE）净化结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）同时检测植物油中胆固醇和维生素E四种异构体（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚）的分析方法。样品采用氨基固相萃取小柱提取净化，洗脱液经DB-5MS色谱柱分离，GC-MS选择离子监测模式（SIM）测定。实验表明，胆固醇和维生素E四种异构体在各自浓度范围内线性关系良好。方法的回收率为83.9%～108.0%，相对标准偏差（RSD）为1.3%～9.3%，胆固醇和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的检出限分别为0.2mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.0mg/kg、0.8mg/kg。结果表明，该方法结果可靠，可用于日常检测。

植物油；胆固醇；维生素E；固相萃取；气相色谱-质谱联用法

维生素E和胆固醇含量是食用植物油中的重要质量指标，快速、准确地检测食用植物油中的维生素E和胆固醇含量对鉴定食用植物油产品的质量和营养价值具有积极意义，是食品检测领域的重要课题。

维生素E（vitam in E，VE）是一种脂溶性维生素，对维持人体正常生理功能起重要作用，能延缓人体衰老，促进性激素分泌，提高生育能力等；此外，维生素E也是一种重要的抗氧化剂，能减缓食品氧化变质。维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类8种化合物，其中生物效价较高的4种是α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚[1]。

而胆固醇（又称胆甾醇）则是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇并非是有害物质，它存在于动物体内，是形成动物组织细胞膜、胆汁酸、维生素D以及甾体激素的原料。但过多食用胆固醇会引发高血脂症，诱发一系列心脑血管疾病，由于食用植物油中一般不含或含有较少量的胆固醇，因此检测食用植物油中的胆固醇成分可以鉴别产品是否掺杂，是否含有胆固醇含量较高的动物油脂，从而推测食用植物油中是否混有地沟油[2]。

目前，维生素E的检测方法有比色法、分光光度法、光谱法、电化学法和色谱法，而色谱法又包括气相色谱法、高效液相色谱法和超临界色谱法[3-4]，胆固醇的检测方法有比色法、气相色谱法、气相色谱质谱联用法、高效液相色谱法等[5-8]，但关于维生素E和胆固醇同时检测的文献报道甚少，仅有个别文献介绍采用气相色谱法同时检测鸡蛋中α-生育酚和胆固醇[9]。由于植物油中胆固醇含量较少，因此需采用适当的富集手段。固相萃取（solid phaseextraction，SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的[10]。固相萃取作为样品前处理技术，已广泛应用于食品、环境等样品的检测中[11]。本研究提出用固相萃取法处理食用植物油样品，气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法[12-13]同时检测样品中的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和胆固醇[14]。目的是开发出一种简便快捷且抗干扰能力强的方法，用于同时检测植物油中的维生素E和胆固醇，对于提高食品日常检测的效率和可靠度具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆油、玉米油、花生油、葵花籽油等食用植物油均购自本地市场；正己烷（色谱纯）；丙酮水（98∶2，V/V）混合溶液（色谱纯）、维生素E标准品（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚），纯度均＞98%：美国Supelco公司；胆固醇标准品（纯度99.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；弗罗里硅土固相萃取柱（1 g，6m L）、氨基固相萃取柱（1 g，6m L）：CNW Technologies公司；硅胶固相萃取柱（500mg，3m L）：美国phenomenex公司；去离子水（18.2MΩ·cm）：美国M illipore公司。

1.2 仪器与设备

7890A GC-5975C气相色谱-质谱联用仪（配7683自动进样器）：美国Agilent公司；MS2M inshaker涡旋振荡器：德国IKA公司；固相萃取装置：美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理方法

准确称取0.5 g植物油样品（精确至0.01 g）于10m L具塞试管中，加入约5m L正己烷，加盖，涡旋分散1min，将全部样液转移至氨基固相萃取小柱（使用前用10m L正己烷活化）中，用20m L正己烷淋洗，抽干柱子并弃去以上步骤流出液。用8m L洗脱液（98∶2丙酮和水混合溶液）洗脱，收集于10m L比色管，以上步骤控制柱子流速在1m L/min。然后用洗脱液将收集液定容至10m L，经0.22μm聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）微孔膜过滤，滤液供气相色谱-质谱联用仪分析。

1.3.2 标准溶液的配制

标准储备溶液：分别精确称取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和胆固醇标准品各25mg至25m L棕色容量瓶中，以正己烷定容至刻度，配置成1 000mg/L的单一标准储备液，4℃冰箱中保存备用。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚使用前按GB/T 5009.82—2003《食品中维生素A和维生素E的测定》进行浓度校正。

混合标准中间液：量取适量α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和胆固醇标准储备溶液，配制成质量浓度为100mg/L的混合标准中间液。

混合标准工作液：吸取混合标准中间液0.025m L、0.05m L、0.1m L、0.5m L、1.0m L至10m L容量瓶中，用丙酮定容。配制成质量浓度为0.25mg/L、0.50mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L和10mg/L的系列标准工作溶液。由于维生素标准品易受光照、温度等环境因素的影响，因此配制过程中要保证避光、现配现用。对于超出曲线范围的样品应做适当稀释使之在线性范围内再进行测量。

1.3.3 气相色谱-质谱条件

气相色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm× 0.25μm）；载气为高纯度氦气（纯度99.999%），流速1.5m L/m in；进样口温度250℃；升温程序为初始温度220℃保持5min，然后以10℃/m in升至280℃，保持15m in，再以20℃/m in升至300℃，保持2min，进样量1μL；不分流进样。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电离能量70 eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；传输线温度280℃；溶剂延迟6m in，采用选择离子扫描定量。目标物的保留时间、特征离子见表1。

表1 胆固醇和维生素E四种形式的保留时间、特征离子Table 1 Retention time,characteristic ions of cholesteroland four kinds of vitam in E isomers

1.3.4 实验参数优化方法

以5种目标化合物的回收率为评价指标，分别考察分散溶剂为正己烷、丙酮以及二氯甲烷时，固相萃取柱为弗罗里硅土固相萃取柱、氨基固相萃取柱、硅胶固相萃取柱，淋洗溶剂（正己烷）用量为5～25m L，洗脱溶剂（丙酮水混合溶液）的水百分含量为1.0%～5.0%时，各参数对目标化合物的回收率的影响，确定前处理条件的最优参数；并对色谱柱的类型进行考察，以目标化合物的分离度及响应值作为评价指标，优选出理想的色谱柱。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件的优化

2.1.1 分散溶剂的选择

植物油样品黏度较大，上柱前应进行稀释，选择与油互溶性良好的有机溶剂（正己烷、丙酮以及二氯甲烷）作为分散剂，比较3种溶剂对加标量为20mg/kg的加标样品的分散情况及5种目标化合物在氨基固相萃取柱上的回收率，回收率计算结果见表2。

表2 不同分散溶剂对各目标物回收率的影响Table 2 Effect o f different dispersion so lvent on the recovery rate of each target compound

由表2可知，用极性较大的丙酮和二氯甲烷作为分散剂稀释样品上柱时，目标物在固相萃取柱上的保留率为22.4%～36.5%，而用正己烷稀释油样上柱时，5种目标物回收率达92%以上，因此选择正己烷作为分散剂对样品进行稀释后上柱富集净化。

2.1.2 固相萃取柱的选择

分别使用弗罗里硅土固相萃取柱[15]、氨基固相萃取柱、硅胶固相萃取柱[2]3种正相萃取柱对加标量为20mg/kg的加标样品进行富集净化处理，以20m L正己烷淋洗，10m L 98%丙酮水溶液洗脱，比较其净化回收率。结果如图1所示，3种固相萃取柱对5种目标化合物的净化回收率均较好，而氨基柱回收率最接近100%，因此选择氨基柱作为净化固相萃取柱。

图1 不同固相萃取柱净化回收率比较Fig.1 Comparison of purification recovery rate of different solid phase extraction

2.1.3 淋洗溶剂和洗脱溶剂的考察

选择氨基固相萃取柱净化常用的淋洗溶剂正己烷，考察其用量分别为5m L、10m L、15m L、20m L和25m L时对杂质的淋洗效果及回收率，结果见图2。由图2可知，淋洗剂用量对回收率的影响不大，但用量20m L以上色谱的总离子流图显示杂质较少，因此选择正己烷淋洗剂用量为20m L。

图2 样品的GC-MS分析总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of samples analysis by GC-MS

氨基固相萃取柱净化常用极性溶剂作为洗脱液，丙酮是强极性溶剂，能把目标物从固相萃取柱中洗脱出来，加入一定量的水能降低填料对目标物的吸附能力从而更易被洗脱，最终目的是使目标物最大程度随洗脱液流出。但有文献实验表明，含水量过多会使回收率降低[6]，同时由于气相色谱柱对水仅有一定耐受性，进样初期水分未能完全挥发可能会损害色谱柱。因此要控制水分的比例。实验对比了水的含量分别是1.0%、2.0%、3.0%和5.0%的丙酮溶液对5种目标物的洗脱效果，回收率计算结果见图3。由图3可知，丙酮中水的百分含量在2%以上时可获得良好的回收率，为了保护色谱柱，选择丙酮∶水（98∶2，V/V）作为洗脱溶剂。

图3 丙酮中水的百分含量对净化回收率的影响Fig.3 Effect of the percentage ofwater in acetone on purification recovery rate

2.2 色谱条件的优化

本研究的5种目标化合物均是环链型结构，极性基团较少，因而极性较弱，因此选择极性较弱的色谱柱进行分离，考察DB-1MS和HP-5MS毛细管气相色谱柱对目标物的保留和分离情况[16]，在优化的条件下5种目标化合物的SIM模式下总离子流色谱图见图4。

图4 DB-1 MS（A）和HP-5 MS（B）色谱柱分离5种目标化合物的总离子流色谱图Fig.4 Total ion chrom atogram s of five target compounds separation by co lumn DB-1 MS(A)and HP-5 MS(B)

由图4可知，两种色谱柱对5种目标物均有较好的保留，分离情况良好，但是DB-1MS的保留时间稍长，且HP-5 MS的应用更为广泛，因此选择HP-5MS作为分离的色谱柱。

2.3 线性关系、检出限

在优化条件下，对系列标准溶液进行测定，以标准溶液的质量浓度（x，mg/L）为横坐标，相应的峰面积（y）为纵坐标，拟合线性方程和相关系数R，结果见表3。

表3 目标物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Tab le 3 Linear equation,correlation coefficient,detection lim it and quantitative lim it of target com pounds

由表3可知，5种目标物在0.25～10mg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数R均＞0.999。以3倍信噪比（S/N=3）计算检出限，结合样品的前处理过程，计算出方法的检出限为0.2～2.0mg/kg。

2.4 精密度和回收率

选择大豆油样品进行了低、中、高3个水平的加标回收实验，加标量分别为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，每个加标水平平行测定6次，对中间加标水平连续测量5 d，计算方法的回收率和精密度，结果见表4。

表4 回收率与精密度测试结果Table 4 Results of recovery rate and precision tests

由表4可知，5种目标物的平均回收率为83.9%～108.0%，日内精密度相对标准偏差（relativestandard deviation，RSD，n=6）为1.3%～9.3%，日间精密度（n=5）相对标准偏差（RSD）为5.2%～9.3%，表明该检测方法具有良好的精密度和准确性。

2.5 实际样品的测定

采用本方法对从市场购买的10份植物油（大豆油2份、玉米油3份、花生油2份和葵花籽油3份）中胆固醇及维生素E进行分析，结果见表5。

表5 实际样品检测结果Table 5 Determ ination results of actualsamples

由表5可知，样品中均检出胆固醇，含量为0.41～0.74mg/kg，玉米油和葵花籽油均检出维生素E，含量范围为12.9～632mg/kg。

3 结论

本实验建立了气相色谱-质谱法同时检测食用油中胆固醇和四种维生素E含量的方法，样品中的胆固醇和维生素E经过氨基固相萃取柱净化提取，用气相色谱-质谱技术进行分离分析，外标法定量分析，方法的精密度和回收率均满足实验检测要求，检出限低，与现行国标相比，样品经过固相萃取柱净化处理并采用具有强抗干扰能力的气相色谱-质谱法检测，有效降低样品基质对检测结果的影响；且能同时检测植物油中两项重要指标胆固醇和维生素E，更好地满足日常检测需要。

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Simultaneousdeterm ination of cholesteroland vitam in E in vegetableoilby solid phase extraction and gas chromatography-massspectrometry

YANWanying,XIAN Yanping,LIN Xiaojia,WANGQiang,GUO Yanhua,LIXiuying*
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,Guangzhou 511400,China)

An analysismethod wasestablished for the simultaneousdetection of cholesteroland four kindsof vitam in E isomers(alpha tocopherol,beta tocopherol,gamma tocopheroland delta tocopherol)in vegetableoilusing solid phaseextraction(SPE)and gas chromatography-massspectrometry (GC-MS).Sampleswere concentrated and purified by NH2SPE cartridges.The eluentwas separated by DB-5MS capillary chromatographic column and detected by selected ionmonitoring(SIM)modeof GC-MS.Experiments resultsshowed that the cholesteroland four kindsof vitam in E isomers were linear in their respective concentration range.The recovery rate of themethod for target compoundswas83.9%-108.0%.The relative standard deviation(RSD)was1.3%-9.3%.Limits of detection of cholesterol and alpha tocopherol,beta tocopherol,gamma tocopherol and delta tocopherol were 0.2mg/kg,1.0mg/kg,2.0mg/kg,2.0mg/kg,and 0.8mg/kg,respectively.The results showed that the analysismethod was reliable and can be used for daily inspection.

vegetableoil;cholesterol;vitamin E;solid phaseextraction;GC-MS

TS207.3

0254-5071（2017）08-0168-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.037

2017-03-08

广东省自然科学基金项目（2016A030310102）

严婉盈（1991-），女，助理工程师，本科，研究方向为食品及相关产品质量安全检测技术。

*通讯作者：李秀英（1984-），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品及相关产品质量安全检测技术。