混合发酵法制备烟用米酒香料的研究

徐达，苏加坤*，倪悦，张晓旭，田耀伟，罗娟敏，罗凌超，蔡继宝

（江西中烟工业有限责任公司技术研发中心，江西南昌330096）

混合发酵法制备烟用米酒香料的研究

徐达，苏加坤*，倪悦，张晓旭，田耀伟，罗娟敏，罗凌超，蔡继宝

（江西中烟工业有限责任公司技术研发中心，江西南昌330096）

以糯米、红枣、无花果为主要原料，采用混合发酵法制备烟用米酒香料，以卷烟感官评价为考察指标进行工艺优化。通过正交试验优化得到最佳制备工艺条件为糯米∶红枣∶无花果质量比5∶1∶1，接种量1%，糖化温度30℃，糖化时间48 h，后发酵时间72 h。对比米酒香料KB，添加了混合发酵米酒香料的卷烟香气、吃味品质均明显提升，评吸得分为90.3分。在最优工艺条件下，对混合发酵米酒和米酒KB的理化指标及致香物质进行分析。结果发现，混合发酵米酒中的总糖、总酸含量均高于米酒KB，而酒精度差别不大；混合发酵米酒香料中致香物质种类可达26种，多于米酒香料KB（11种），其中苯甲醇、苯乙醇、4-羟基-3-甲氧基苯乙醇含量均达到了20mg/L，提高该米酒香料的香气质量。

烟用香料；混合发酵法；米酒；正交试验

糯米富含维生素、淀粉、纤维素等[1]，以糯米为原料发酵制备的米酒是我国传统的特色饮品，口味醇厚甜润，清凉去火，健脾养胃，除了提供特征香气的短链醇、酯类外，还含有大量的糖分、有机酸、维生素等营养物质[2-4]。目前，有研究者通过在糯米发酵过程加入桂花、枸杞、黄精等多种天然产物进行混合发酵制备米酒型风味饮品或保健品，提高了其营养价值和感官品质[5-10]，具备一定的市场认同度。

米酒混合发酵工艺研究注重米酒香气和酸甜吃味，多见于食品领域[11-14]，鲜见于卷烟香精香料领域。在烟草行业，无花果发酵烟用香料、葡萄发酵烟用香料、槐花发酵烟用香料等一系列天然发酵型香料由于增香保润功效明显，近年来逐渐受到烟草研究者青睐，基于米酒类发酵产物“甜”、“润”、“酿香”等特点，将其应用于烟草加工的烟丝加料工序中，可用于提高卷烟感官品质和香气质量。本研究通过选用红枣、无花果这类在卷烟中应用广泛的天然产物与糯米进行混合发酵，提升发酵产物“甜”、“润”吃味，从卷烟单体香料感官评价的角度对其进行筛选和酿造工艺优化，并分析其酒精度、总糖、总酸等理化指标、挥发性致香物质组成，以期为烟用天然产物香精香料的开发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米（产地湖北）、红枣、无花果（产地新疆）：市售；果胶酶Rapidase C 80MAX（酶活≥168 000 U/g）：帝斯曼生物技术有限公司；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；α-淀粉酶（酶活≥2 000U/g）、多种氨基酸、葡萄糖、无水硫酸钠、丙二醇、氨水、二氯甲烷等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890-5973C型气相色谱-质谱联用（gaschromatographymassspectrometer，GC-MS）仪：安捷伦科技有限公司；RE-52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；DH5000BII培养箱：天津泰斯特仪器有限公司；CP2245电子天平：德国Sartorius公司；LDZM-80KCS立式压力灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 混合发酵米酒香料的制备工艺流程

操作要点：

淘洗：除去砂石等杂质，糯米应洗至无白浊，以保证酿出的米酒色泽澄清，无异味。

浸泡：糯米在去杂洗净后放入清水中，保持水面高出约2 cm左右。浸泡糯米的过程要注意换水2～3次，以防止发酸。浸米的质量标准是以米粒浸透无白心，手碾即碎为适度。

混合蒸煮：将浸好的米滤去白浆后，与天然发酵底物混合后置于蒸锅内蒸煮，待冒蒸汽后，每隔5min向米层中撒入适量的温开水以防止米粒粘在一起，再蒸20～30m in即可。

淋饭：以温开水迅速冲淋米饭，温度降至28～32℃，淋饭要求均匀彻底。

拌曲入缸：将淋饭后的米饭放在摊晾板上，加入安琪甜酒曲，同时加入一定量的温开水，搅拌均匀，装入缸内，中间挖一个小孔，然后放入培养箱中培养。

糖化发酵：将缸放在28～32℃恒温培养36 h后，将小孔中的部分糖化液均匀的洒在酒醪的表面，从而使得表面充分发酵，以至酒醪全部漂浮在糖化液的表面。

后发酵：糖化发酵结束后，加入发酵底物质量的20%的冷开水冲缸，将糖化醪放于18～22℃条件下保温24～72h，后发酵结束。

成品（卷烟应用）：灭菌后，向米酒中添加2‰的山梨酸钾和10%的1,2-丙二醇，即得米酒香料。米酒香料是以加料的形式应用在卷烟中，即通过喷雾器将其喷洒到某款卷烟叶组上，喷雾量为烟丝质量的2‰，烘丝、打烟，将烟支在25℃、相对湿度60%的环境中平衡48 h后，首先参照单体香料在卷烟中作用评价方法对其香气特征、口感特征、烟气特征三个方面进行描述[15-16]，然后参照GB 5606.4—2005《卷烟第4部分：感官技术要求》对其光泽、香气、谐调、杂气、刺激性和余味六个指标进行评价和计分，满分为100分[17]。

1.3.2 糯米复配物的筛选

以米酒香料KB（以糯米为单一底物发酵制备的米酒）为对照，选择4种发酵底物模型，模型及配比见表1。发酵工艺参照1.3.1节，依据预试验和文献调研结果，选择糖化发酵温度为30℃，糖化时间为36 h，糖化发酵结束后，按照后发酵温度为20℃，发酵时间为48 h。将发酵完成后的米酒香料进行卷烟感官评价和筛选，根据香气特征、口感特征、烟气特征3个方面进行描述。

表1 4种发酵底物模型及配比Table 1 Models and proportions of 4 kinds o f fermentation substrates

1.3.3 制备工艺优化

单因素试验：考察酒曲接种量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%）、糖化温度（25℃、28℃、30℃、32℃、35℃）、糖化时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）、后发酵时间（12 h、24 h、48 h、60 h、72 h）4个因素对混合发酵米酒香料在卷烟中应用效果的影响。

正交试验：在单因素试验结果的基础上，以参照GB 5606.4—2005《卷烟第4部分：感官技术要求》得到的评吸分数为评价指标，选择酒曲接种量（A）、糖化温度（B）、糖化时间（C）、后发酵时间（D）4个因素进行L9（34）正交优化试验，试验因素与水平见表2。

表2 制备工艺优化正交试验水平与因素Table 2 Factors and levels of orthogonalexperim ents for p reparation techno logy op tim ization

1.3.4 理化指标分析及其致香物质检测

米酒香料的理化指标按照烟草行业标准YC/T 145—2012《烟用香精》进行测定。致香物质分析采用GC-MS对实验样品进行分析检测。预处理：称取约1m L样品，加4m L二氯甲烷萃取，振荡混匀，静置分层后取下层有机相，萃取三次，合并萃取液，加入50μL十一酸甲酯内标（质量浓度为400μg/m L），减压浓缩至1.5m L待测。

GC-MS条件：色谱柱为HP-INNOWaxPolyethyleneGlycol（30m×250μm×0.25μm）；电离方式：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度250℃，检测器为四级杆质谱仪，载气为氦气（纯度99.9995%），进样温度为250℃；分流比1∶20；流速1m L/m in；程序升温：40℃保持1m in，以4℃/m in升温至250℃，保持15m in；传输线温度250℃；电子能量70 eV；扫描范围30～400 amu。

定性定量分析：使用Wiley和M inilab谱库进行检索定性；采用内标法进行定量，定量计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 糯米复配物的筛选结果

采用红枣和无花果与糯米进行不同比例复配，进行米酒发酵制备并从香气特征、口感特征、烟气特征三个方面感官评吸，评吸结果如表3所示。由表4可知，4种复配样品在卷烟中的应用效果均优于空白样（KB），3#样品（糯米∶红枣∶无花果=5∶1∶1）应用效果最好，2#、4#样品的应用效果次之。根据KB、2#、3#之间的比较发现，红枣在混合发酵物中主要起到提升烟气厚实度的作用，无花果则主要是起到提升烟气甜润感的作用，且红枣的添加量不宜过大，否则会出现压香、烟气粗糙的问题。故选择3#组合进行后续的混合发酵工艺条件优化。

表3 不同配比制备得到的混合发酵物感官评吸结果Table 3 Results of sensory evaluation ofm ixed fermentation p roducts prepared by different proportions

2.2 米酒香料制备工艺条件的单因素试验结果

按3#组合进行混合发酵工艺的单因素试验，结果如图1所示。由图1（a）可知，随着接种量的增加，米酒香料的评吸分数逐渐增加，这说明当接种量＜1%时，增加接种量提升菌种的生长繁殖的速度，有利于无花果、红枣等底物的发酵产香，当接种量为0.7%时，评吸得分已接近较大值，因此选择最佳接种量0.7%为宜。由图1（b）可知，当糖化温度为30℃时，评吸得分达到最大值，这可能是因为较低的糖化温度容易导致发酵不彻底产生酸涩，而当糖化温度达到30℃后，继续升高将不利于菌种生长和糖化。因此选择最佳糖化温度30℃为宜。由图1（c）可知，随着糖化时间的增加，米酒香料的评吸得分逐渐增加到最大值。当糖化时间＞48 h时，评吸得分开始下降，随着糖化时间延长，发酵体系中产生了一些不需要的代谢产物，影响了该米酒香料在卷烟应用中的增香效果。由图1（d）可知，随着后发酵时间的增加，米酒香料的评吸得分逐渐增加到最大值，当发酵时间为48 h时，评吸得分已接近最大值，因此选择后发酵时间48 h为宜。

图1 接种量(a)、糖化温度(b)、糖化时间(c)和后发酵时间(d)对混合发酵米酒香料在卷烟中应用效果的影响Fig.1 Effects of inoculum(a),saccharification tem perature(b), saccharification tim e(c)and post-fermentation tim e(d)on m ixed fermentation rice w ine spice in cigarette app lication

2.3 正交试验结果分析

根据单因素试验结果，选择酒曲接种量（A）、糖化温度（B）、糖化时间（C）、后发酵时间（D）4个因素，通过卷烟感官评吸得分进行制备工艺优化正交试验，正交试验设计与结果如表4所示。

表4 混合发酵米酒制备工艺优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonalexperiments for m ixed fermentation conditions optim ization

由表4可知，极差分析结果表明，对米酒香料在卷烟中应用效果的影响大小依次为酒曲接种量＞糖化时间＞后发酵时间＞糖化温度；最优工艺条件组合为A3B2C3D3，即酒曲接种量1%，糖化温度30℃，糖化时间48 h，后发酵时间72 h。在此最优工艺条件下制备混合发酵型米酒香料，并添加到卷烟中进行品评，评吸得分为90.3分。可见，在最优化工艺条件下，该米酒香料应用在卷烟加料中能明显改善卷烟吸味品质，起到增加甜润感的效果。

2.4 混合发酵法制备的米酒香料理化指标分析

在最优工艺下制备得到的混合发酵米酒香料（3号发酵底物）和米酒香料（KB）的理化指标的分析结果如表5所示。

表5 混合发酵米酒产物的理化指标分析结果Table 5 Analysis results of physicochem ical indexes ofm ixed fermentation rice wine products

由表5可知，在香气方面，混合发酵米酒香料中除了发酵带来的酒香、甜香外，还有令人愉快的成熟果香，且甜香更突出；在外观、相对密度、折光指数和酸价方面，两种米酒产物无明显差别；在挥发性成分总量方面，混合发酵米酒香料略高于米酒香料KB，这是由于混合发酵中引入的大枣、无花果中含有大量香气物质并通过发酵生香，导致其挥发性成分总量增加。

将最优工艺下制备得到的混合发酵米酒与米酒KB进行酒精度、总酸、总糖含量对比分析，结果见图2。由图2可知，在酒精度方面，混合发酵米酒香料和米酒香料（KB）较接近，分别为4.7%vol、4.3%vol；在总糖含量方面，混合发酵米酒香料（206 g/L）高于米酒香料KB（124 g/L），这是由于混合发酵米酒香料中引入了红枣和无花果中大量糖类物质，经糖化、后发酵过程，还原糖用于合成醛、酮、醇及非还原糖类，从而为该米酒烟用香料提供了特征性香气；在总酸含量方面，混合发酵米酒（4.2 g/L）高于米酒KB（2.3 g/L），由于米酒中大部分有机酸是由根霉发酵大米淀粉产生，混合发酵法引入的有机酸是导致混合发酵米酒有机酸升高的主要因素[2]，而有机酸在卷烟中具有降低烟气pH值，降低刺激的作用，故混合发酵米酒香料中较高的有机酸含量使得其在卷烟中应用效果优于米酒香料KB[18]。

图2 混合发酵米酒酒精度、总糖、总酸含量分析结果Fig.2 Analysis results of alcohol content,totalsugar and totalacid content ofm ixed fermentation rice wine

2.5 混合发酵法制备的米酒主要挥发性致香成分分析

对米酒香料中主要挥发性致香成分分析结果见表6。由表6可知，米酒香料KB中共检出11种致香物质，而混合发酵米酒香料中共检出26种致香物质，有15种新物质生成。且混合发酵米酒中致香物质种类多于米酒KB，特别是杂环酮类、醛类、醇类及有机酸类物质，包括2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、5-羟甲基糠醛、2-羟基-5-甲基苯乙酮等与卷烟香气正相关的化学成分[19]。其中，混合发酵米酒中的苯甲醇、苯乙醇、4-羟基-3-甲氧基苯乙醇含量均达到了20mg/L，而这几种对卷烟香气贡献作用明显的物质在米酒香料KB中未检出[20]。由于酮类、醛类、醇类等致香成分阈值较低，这类香气物质对提高米酒香料香气质量、“津”、“甜”吃味的作用明显。

表6 混合发酵米酒主要挥发性致香成分分析结果Table 6 Analysis results ofmain volatile aroma com ponents in m ixed ferm entation rice w ine

3 结论

本研究采用糯米、红枣、无花果作为主要的发酵底物，通过制备工艺优化获得了一种能提升卷烟香气和吃味品质的混合发酵米酒烟用香料。实验得到的最优生产工艺为：糯米∶红枣∶无花果质量比5∶1∶1，酒曲接种量1%，糖化温度30℃，糖化时间48 h，后发酵时间72 h，在此工艺条件下，制备得到的烟用米酒香料能够有效增加卷烟“津”、“甜”吃味，同时对刺激性及杂气具有良好的抑制和掩盖作用，评吸得分可达90.3分。

经理化分析结果发现，该混合米酒香料中总糖含量为206 g/L，总酸含量为4.2 g/L，挥发性成分总量69.8%，均大于米酒香料KB。采用GC-MS对烟用米酒香料进行了定量分析结果发现，混合发酵米酒香料中致香物质种类可达26种，明显多于米酒香料KB，包括杂环酮类、醛类、醇类及有机酸类，特别是混合发酵米酒中的苯甲醇、苯乙醇、4-羟基-3-甲氧基苯乙醇含量均达到了20mg/L，起到了提高米酒香料香气质量的作用。

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Preparation of ricew ine spice bym ixed fermentation for cigarette application

XU Da,SU Jiakun*,NIYue,ZHANG Xiaoxu,TIAN Yaowei,LUO Juanm in,LUO Lingchao,CAIJibao
(Technology Research and DevelopmentCenter,China Tobacco Jiangxi IndustrialCo.,Ltd.,Nanchang 330096,China)

Using glutinous rice,red date and fig as themain raw materials,ricew ine spice for cigarette application was prepared bymixed fermentationw ith smoke sensory evaluation as indexes,the preparation technology wasoptim ized by orthogonalexperiments.Theoptimum preparation technology conditionswere determined as follows:glutinous rice∶red date∶fig 5∶1∶1,inoculum 1%,saccharification temperature 30℃,time 48 h and post-fermentation time72 h.Compared to the ricew ine spice KB,the tobacco aromaand smokequality of cigarettewith addition ofm ixed fermentation ricew ine spicewere improved significantly,and the smoking scorewas90.3.Under theoptimum technology conditions,the physicochemical indexes and aroma components ofm ixed fermentation ricew ine and ricew ine KB were analyzed.The results showed that the contents of total sugar and total acids inm ixed fermentation ricew inewere higher than thatof ricewine KB,but the difference in alcohol contentwasnotobvious.There were26 kindsofaromatic substances inm ixed fermentation ricew ine spice,whichwasmore than thatof ricew ine spice KB(11 kinds),the contentsof phenylcarbinol,phenethylalcoholand4-hydroxy-3-methoxyphenylethanolallreached20mg/L,and thearomaqualityof thericew inespicewasimproved.

cigarette spice;mixed fermentation;ricewine;orthogonalexperiments

TS262.7

0254-5071（2017）08-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.033

2017-03-21

江西中烟工业有限责任公司科技项目（赣烟工科计2014-5）

徐达（1987-），男，工程师，硕士，主要从事烟用香料、烟草生物技术方面的研究。

*通讯作者：苏加坤（1981-），男，工程师，博士，主要从事烟草化学方面的研究。