海洋低温淀粉酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

周新尚，逄飞，窦少华，3*，乔慧，迟乃玉

（1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连116622；2.辽宁省海洋微生物生物工程技术研究中心，辽宁大连116622；3.大连理工大学生命科学与技术学院辽宁大连116024）

海洋低温淀粉酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

周新尚1，2，逄飞1，2，窦少华1，2，3*，乔慧1，2，迟乃玉1，2

（1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连116622；2.辽宁省海洋微生物生物工程技术研究中心，辽宁大连116622；3.大连理工大学生命科学与技术学院辽宁大连116024）

以大连黄海海泥和海水为样品，采用稀释涂布平板透明圈法初筛、摇瓶发酵复筛，得到一株淀粉酶高产菌ZXS-5，测得酶活为6.25U/m L。通过形态学、生理生化及16S rDNA序列鉴定，菌株ZXS-5为荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）。该酶的最适作用温度为25℃，酶的热稳定性相对较差；最适作用pH值为8.0，属于碱性酶，该酶在酸性条件下稳定性较差；Ba2+、Cu2+、乙二胺四乙酸（EDTA）对该酶抑制性较强，Fe2+、Zn2+、Mn2+对该酶的活性影响不明显，Mg2+、Na+对该酶激活作用较弱，Ca2+对该酶激活作用较强。

低温淀粉酶；鉴定；荧光假单胞菌；酶学性质

淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖等一系列低聚糖酶类的总称[1]。淀粉酶可从淀粉分子内部催化α-1,4糖苷键及α-1,6糖苷键水解。根据作用方式不同归类为α-淀粉酶和β-淀粉酶，水解产物为小分子单糖和高分子极限糊精等[2-4]。

淀粉酶是目前研究最多，应用范围最广的工业酶制剂之一，尤其在淀粉深加工、食品、燃料酒精、纺织品脱胶等行业起着要重要作用[4]。但目前市场所用淀粉酶多为中温酶或高温酶，在低温环境（0～20℃）下酶活性较差，限制了其在洗涤、食品等对低温要求苛刻行业上的进一步应用。而低温淀粉酶的最适反应温度≤40℃且对热敏感，相比中温或高温酶潜在的应用价值更高，因此，自20世纪70年代以来，对低温淀粉酶资源的开发成为功能酶研究的新热点[5-7]。

本研究以于大连黄海的海水和海泥为样品，初筛得到10株低温淀粉酶产生菌，复筛过程中菌株ZXS-5的酶活最高，进而对菌株ZXS-5进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定，并对菌株ZXS-5所产低温淀粉酶酶学性质进行初步研究。以期为海洋低温淀粉酶资源的开发利用提供一定的工作基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：大连黄海海水和海泥；蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾、可溶性淀粉、牛肉膏、葡萄糖、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸镁、琼脂粉：生物工程（上海）股份有限公司；核酸Marker：大连宝生物有限公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。

富集培养基：可溶性淀粉30 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂16 g/L，pH 7.0。0.1MPa灭菌30m in。

初筛培养基：可溶性淀粉30 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂16 g/L，pH 7.0。0.1MPa灭菌30m in。

复筛培养基：可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨6 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 7.0，0.1MPa灭菌30min。

种子培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl5 g/L，pH 7.4。0.1MPa灭菌30min。

斜面保藏培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂16 g/L，pH 7.4，0.1MPa灭菌30m in。

发酵培养基：同复筛培养基。

1.2 仪器与设备

SPX-250全温振荡培养箱：常州万科仪器科技有限公司；M IR-254低温恒温培养箱：上海创奕科教设备有限公司；HH-6数显控恒温水浴锅：深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司；DHG-914A电热恒温鼓风干燥箱：上海和呈仪器制造有限公司；UV-5100B紫外可见分光光度计：上海重逢科学仪器有限公司；LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯医疗器械厂；GRX-02A干热灭菌箱：上海森信实验仪器有限公司；API-9700型基因扩增仪：美国ABI有限公司；DYCP-32B型核酸电泳仪：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制备方法

复筛得到的菌株接种于装液量为200m L/500m L发酵培养基中，接种量4%，20℃、150 r/m in培养36 h。发酵液于4℃、8 000 r/m in离心15min，上清液即为粗酶液。

1.3.2 淀粉酶酶活测定方法

淀粉酶酶活测定参照OKOLO BN等[8]方法。反应体系如下：25m L具塞比色管中加入2.0m L 2%的可溶性淀粉糊化液、2m L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 6.4），25℃预热5min，加入1.0m L粗酶液，25℃、160 r/m in振荡反应5m in，加入终止反应试剂3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）2m L，移液抢吹打混匀，煮沸5m in。取出后流水冷却，加去离子水定容至20m L。空白对照：将1.0m L酶液替换为1.0m L醋酸-醋酸钠缓冲液（其余条件同上），在波长525 nm条件下比色测定吸光度值[9]。淀粉酶酶活单位定义：在分析条件下，1m in释放1μmol的还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，酶活力单位为U/m L。还原糖以葡萄糖为标准品，采用二硝基水杨酸（DNS）法进行测定[10]。

1.3.3 菌株筛选

（1）菌种初筛：大连黄海海水和海泥各15份，海泥取2.0 g，海水10m L加入装有50m L无菌生理盐水的三角瓶中，剧烈振荡5min，静置30min取上清液2m L接种于富集培养基中，在20℃、150 r/min振荡培养3 d，取2m L菌液接种于相同的富集培养基中再次定向富集3 d。采用平板划线法，将富集培养后的菌液梯度稀释，涂布在平板筛选培养基上。20℃培养2～5d，以菌落周围是否出现透明圈（卢戈氏碘液染色法）为初筛标准，挑取带有透明圈的单菌落进一步平板划线纯化，保藏初筛菌株，进行后续实验[11]。

（2）菌种复筛：将初筛菌株接种于100m L/250m L发酵培养基中，20℃、150 r/min培养36h，以发酵液中低温淀粉酶的酶活作为复筛标准，复筛得到产低温淀粉酶酶活最高的菌株[12]。

1.3.4 菌落形态特征

在初筛培养基上观察菌落的形状、大小、颜色等形态学特征，通过革兰氏染色在光学显微镜（10×100）下观察菌体形态。

1.3.5 鉴定菌株生理生化特征

根据《常见细菌系统鉴定手册》（第8版）[13]细菌鉴定相关标准设计实验，主要包括葡萄糖氧化发酵测定、氧化酶反应、接触酶反应、硝酸盐还原试验、产生吲哚试验、淀粉水解试验、糖、醇类发酵试验、脲酶试验、硫化氢产生、含碳化合物的利用、柠檬酸盐的利用等。

1.3.6 菌株分子生物学鉴定

采用TIANGEN柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株DNA。以提取到的ZXS-5菌株DNA为模板，16S rDNA扩增引物采用细菌通用引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。其引物如下：正向引物P1（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和反向引物P2（5'-AA GTCGTAACAAGGTAACC-3'）进行PCR扩增。将PCR扩增产物进行核酸电泳，同时将PCR扩增产物送交上海生工生物有限公司测序，将测序结果提交到GenBank数据库中，经基本局部比对搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）序列比对，利用MEGA5软件构建系统发育树[14]。

1.3.7 酶学性质研究

（1）酶的最适作用温度：将粗酶液分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃条件下，按照低温淀粉酶的酶活力测定方法测定酶活，以同组最高酶活为100%计算相对酶活，进行3组平行实验。

（2）酶的热稳定性：将粗酶液分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴中持续保温60min，并分别在10m in、20min、30m in、40min、50min和60m in测定低温淀粉酶剩余酶活力，以同组最高酶活为100%计算相对酶活，每次进行3组平行试验。

（3）酶的最适作用pH：在酶最适作用温度条件下，酶活测定体系中把醋酸-醋酸钠缓冲液换为pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的磷酸盐缓冲液测定低温淀粉酶酶活，以同组最高酶活为100%计算相对酶活，每次进行3组平行试验。

（4）酶的pH稳定性：分别将低温淀粉酶粗酶液至于pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0磷酸盐缓冲液中，25℃保育60m in，测定低温淀粉酶酶活，以同组最高酶活为100%计算相对酶活，每次进行3组平行试验。

（5）化学试剂对酶活影响：在酶最适作用条件下，酶液中分别加入去离子水、CaCl2、NaCl、MgSO4、FeCl、CuSO4、ZnSO4、MnCl2、及乙二胺四乙酸（ethylenediam ine tetraacetic acid，EDTA）等化学试剂，各反应体系中金属离子的终浓度为10mmol/L，测定低温淀粉酶酶活，以添加去离子水为对照组计算相对酶活，每次进行3组平行试验。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

实验样品经过初筛，得到10株（菌株ZXS-1～ZXS-10）能够产生透明圈的菌株，经摇瓶发酵复筛测定其低温淀粉酶淀粉酶活力，结果如表1所示，菌株ZXS-5的低温淀粉酶活力最高，其最高酶活为6.25U/m L。与国内一些研究报道相比，菌株ZXS-5所产低温淀粉酶酶活较高，可用于工业生产。

表1 菌株产低温淀粉酶酶活比较Tab le 1 Com parison of low-tem perature am ylase activity produced by strains

2.2 菌株ZXS-5的菌落及形态特征

菌株ZXS-5的菌落及细胞形态特征见图1。由图1A可知，菌株ZXS-5的菌落呈黄色、圆形、不生孢、不透明、边缘整齐，表面光滑湿润。由图1B可知，菌株ZXS-5的显微形态呈杆状，为革兰氏阴性菌。

图1 菌株ZXS-5菌落形态(A)及显微形态(B)Fig.1 Co lonialm orphology(A)and m icroscopic m orphology(B)of strain ZXS-5

2.3菌株生理生化特性

表2 菌株ZXS-5生理生化特征Tab le 2 Physiologicaland biochem ica lcharacteristics of strain ZXS-5

由表2可知，菌株ZXS-5生理生化特征为：淀粉水解试验、明胶液化试验、尿素水解试验、精氨酸双水解、过氧化氢酶试验、反硝化试验、果聚糖形成试验结果均为阳性，油脂水解试验、氧化酶试验、从甘油产生二羟基丙酮试验、氨基酸脱羧酶反应试验结果均为阴性。由生理生化试验结果可初步鉴定其为假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.）。

2.4 16S rDNA序列分析与系统发育树的构建

菌株ZXS-5的16SrDNA扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2。由图2可知，获得一条清晰的条带，根据Maker定量分析菌株ZXS-5的16SrDNA序列大小为1498bp。

图2 菌株ZXS-5 16S rDNA PCR扩增电泳图Fig.2 PCR am plification electrophoretogram of 16S rDNA of strain ZXS-5

将菌株ZXS-5的16S rDNA序列输入美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）数据库中Nucleotide BLAST与GenBank数据库中同源性最高的己知分类菌株序列进行比较，用软件MEGA5以邻接（neighbor-joining，NJ）法进行系统发育树构建如图3所示。由图3可知，菌株ZXS-5与荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescensstrain（NR 114476.1）同源性最高为99%，因此可以鉴定菌株ZXS-5为荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）。

图3 菌株ZXS-5 16S rDNA序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain ZXS-5 based on 16S rDNA sequence

2.5 酶学性质研究

2.5.1 低温淀粉酶的最适反应温度

由图4可知，低温淀粉酶的最适酶促反应温度为25℃，而酶在40℃以后活力迅速下降，但是低温淀粉酶在10℃仍有一定的酶活力，低温淀粉酶的这种特性符合低温酶的标准[15]。这对于需要加热的淀粉工业来说，低温酶减少了能量消耗、降低了生产成本具有重大的现实意义。

图4 低温淀粉酶的最适作用温度曲线Fig.4 The optimum tem perature curve o f low-temperature amylase

2.5.2 低温淀粉酶的热稳定性

图5 低温淀粉酶的热稳定性Fig.5 Therm alstability of low-temperature am ylase

由图5可知，低温淀粉酶在20～40℃之间酶活保持较高，酶的活性相对稳定热；从50℃开始，酶活急剧下降；60℃处理1 h，酶活基本为0。所以低温淀粉酶在相对宽泛的温度环境下，热稳定性较差，这也表明低温淀粉酶在某些特殊生产工艺中有重要的应用价值[16]。

2.5.3 低温淀粉酶的最适作用pH

图6 pH对低温淀粉酶酶活的影响Fig.6 Effect of pH on the activity of low-temperature am ylase

由图6可知，该酶在pH4.0～7.0时酶活迅速下降，在pH 8.0时酶活最高，在pH 8.0～10.0时酶活略有下降，说明该低温淀粉酶的最适酶促反应pH值为8.0，该酶属于碱性酶。此外该碱性淀粉酶在洗涤行业中具有广阔的应用前景。2.5.4低温淀粉酶的pH稳定性

图7 低温淀粉酶pH稳定性Fig.7 pH stability of low-tem perature am ylase

由图7可知，该酶经pH 8.0的缓冲液作用60m in，酶活力基本保持不变，所以该酶的最适pH为8.0。当pH＞8.0时，该酶酶活力呈下降趋势。该酶在pH8.0～9.0保持80%的相对酶活，在pH 10.0时也保持50%以上的相对酶活。但是在pH 5.0～6.0的缓冲液作用下酶活迅速下降，说明该酶是碱性酶，在酸性条件下酶的稳定性较差，所以应该在碱性条件下利用该酶。

2.5.5 化学试剂对酶活影响

表3 金属离子与EDTA对低温淀粉酶活的影响Table 3 Effects ofm etal ions and EDTA on the activity of low-tem perature am ylase

由表3可知，Ba2+、Cu2+、乙二胺四乙酸（ethylenediam ine tetraacetic acid，EDTA）对该酶抑制性较强，Fe2+、Zn2+、Mn2+对该酶的活性影响不明显，Mg2+、Na+对该酶激活作用较弱，Ca2+对该酶激活作用较强。由此可见该酶属于金属酶类[17]。

3 结论

本实验从大连黄海海泥与海水中共筛选出10株产低温淀粉酶的菌株，其中ZXS-5具有最高的低温淀粉酶活力，为6.25U/m L。菌株ZXS-5所形成的菌落呈黄色、圆形、不生孢、不透明、边缘整齐，表面光滑湿润。经过显微观察该菌株菌体呈杆状，为革兰氏阴性菌。该菌经生理生化、16S rRNA鉴定，结果鉴定菌株ZXS-5为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。菌株ZXS-5与其他国内外筛选的产淀粉酶的菌株相比[18]，具有适应低温环境（20℃），耐盐性极好，耐高压等优良特征。对菌株ZXS-5所产的低温淀粉酶酶学性质初步研究表明，该酶的最适作用温度为25℃，作用温度较低，属于低温酶类，最适作用pH值为8.0，属于碱性淀粉酶；该酶活性对Ca2+的依赖明显，Na+、Mg2+对该酶具有一定的促进作用，Fe2+、Zn2+、Mn2+对该酶的活性影响不明显，而Ba2+、 Cu2+及EDTA较明显的抑制该酶的活性，由此可见该酶属于金属酶类。

本研究筛选和探究了低温微生物和低温酶的一些特性，为低温淀粉酶的开发和利用做了初步的研究，该酶的分离纯化及工业发酵奠定了基础。

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Isolation,identification and enzymatic property ofa low-temperatureamylase-producing strain from marine

ZHOU Xinshang1,2,PANG Fei1,2,DOU Shaohua1,2,3*,QIAO Hui1,2,CHINaiyu1,2
(1.SchoolofLife Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Technology ofMarine M icrobiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China; 3.SchoolofLife Science and Biotechnology,Dalian University ofTechnology,Dalian 116024,China)

Using seamud and seawater from Dalian Yellow Sea as samples,a higher amylase-producing strain ZXS-5 was obtained by spread plate method preliminary screening and shake flask fermentation secondary screening,and the enzyme activity was 6.25 U/m l.Through morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence identification,strain ZXS-5 was identified as Pseudomonas fluorescens.The optimum temperature of theamylasewas25℃and its thermostability was relatively poor.The optimum pH of the amylasewas8.0,and itwasalkaline amylase,and the pH stability wasweak in acidic condition.The amylase activity was strongly inhibited by Ba2+,Cu2+and ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA).The effects of Fe2+,Zn2+and Mn2+on the amylase activity were not obvious.The amylase activity was slightly activated by Mg2+and Na+,strongly activated by Ca2+.

low-temperatureamylase;identification;Pseudomonasfluorescens;enzymatic property

Q93-331

0254-5071（2017）08-0057-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.013

2017-05-21

国家高技术研究发展计划“863计划”项目（No.2014AA093512）；辽宁省自然科学基金项目（No.2014020134）

周新尚（1990-），男，硕士研究生，研究方向为微生物工程及酶工程。

*通讯作者：窦少华（1979-），男，副教授，博士，研究方向为微生物工程及酶工程。