肠道病毒与宿主固有免疫系统相互作用的研究进展①

谢金炎 程安春 汪铭书

(四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心，成都611130)

肠道病毒与宿主固有免疫系统相互作用的研究进展①

谢金炎②③程安春②③汪铭书②③

(四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心，成都611130)

肠道病毒(Enterovirus，EV)属于小RNA病毒科，为无囊膜、单股正链RNA病毒，包括肠道病毒A- D型、鼻病毒A- C型以及肠道病毒E- J型等共12个属，包含多种人类和动物病毒，如肠道病毒71型(EV- 71)、柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)等[1,2]。在感染肠道病毒后可表现出不同的症状，如隐性感染、非典型性发热、中枢神经系统疾病(例如无菌性脑膜炎、脑炎、非脊髓灰质炎麻痹)、心肌炎、心包炎、呼吸道疾病、手足口病等，严重危害人类的健康[3]。

在病原微生物感染宿主的早期，Ⅰ型干扰素以及干扰素刺激基因的表达发挥着重要的抗病毒作用，固有免疫系统首先通过模式识别受体(pattern- recognition receptors，PRRs)识别病原微生物成分，激活相应的信号通路产生Ⅰ型干扰素，抑制病毒的复制[4]。病毒在与宿主的长期斗争过程中，进化出了一系列的免疫逃避机制，实现自身的复制和增殖。

1 固有免疫系统对肠道病毒的识别

小RNA病毒主要被三种经典的模式识别受体所识别:Toll样受体(Toll- like receptors，TLRs)、维甲酸诱导基因- Ⅰ样受体(Retinoic acid- inducible gene Ⅰ- like receptors，RLRs)以及核苷酸的寡聚化结构域样受体[Nucleotide oligomerization domain(NOD)- like receptors，NLRs][4]。其中TLRs和RLRs对于Ⅰ型干扰素以及多种细胞因子的产生起到非常重要的作用，而NLRs可以通过激活半胱天冬酶- 1(Caspase- 1)来调节IL- 1β和IL- 18的成熟。

1.1 TLR对肠道病毒的识别 TLRs是一种跨膜蛋白，能够在细胞外和细胞质空泡中识别病毒成分。哺乳动物的TLRs有10种以上，其中TLR2、TLR3、TLR4、TLR7以及TLR9参与识别病毒的成分[5]。TLR2和TLR4定位于细胞膜上，能在细胞表面参与识别病毒的包膜蛋白，并在细菌成分、脂蛋白和脂多糖的识别过程中起到重要的作用。TLR3、TLR7以及TLR9定位于细胞质小泡上，如核内体和内质网，识别病原微生物的核苷酸，例如，TLR3主要识别双链RNA，TLR7主要识别单链RNA，而TLR9主要识别非甲基化胞苷- 磷酸盐- 鸟苷(Cytidine- phosphate- guanosine，CpG)DNA[6]。

TLRs在识别病原微生物之后，立即招募TIR接头分子，如髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)和干扰素β TIR结构域衔接蛋白(TIR domain- containing adapter inducing IFN- β，TRIF)，并呈递到下游分子。在识别病毒的双链RNA时，TLR3信号通路将被TRIF接头分子激活，并依次招募肿瘤坏死因子受体相关因子3(Tumor necrosis factor receptor- associated factor 3，TRAF3)，随后，TRAF3会激活两个相关激酶，IKK- α/β/ε和TBK1，而这两个激酶又会介导干扰素调节因子3/7(Interferon regulatory factor 3/7，IRF 3/7)的磷酸化作用，最后IRF 3/7会进入到细胞核，并刺激产生Ⅰ型干扰素和细胞因子[7]。在CVB3感染TLR3和TRIF敲除小鼠实验中发现，小鼠体内有严重的炎症反应且病毒大量增殖，并造成了更严重的心肌炎[8]，这表明在CVB3感染过程，宿主通过TLR3信号通路介导了固有免疫反应。

和TLR3不同，TLR4的确切作用还没有被完全阐述清楚。Riad等[9]将小鼠中TLR3和TLR4的下游受体TRIF缺失掉，再用CVB3感染，发现小鼠IFN- β的诱导受损，随之产生了严重的心肌病变，死亡率高达100%。因此，推测在CVB3感染中TLR4可能作为一个重要的抗病毒分子发挥作用，但尚需在TLR4敲除的模式小鼠上进一步验证。也有研究发现[10]，在CVB3诱导的心肌炎恢复阶段，机体会诱导TLRs、RLRs、PKR和细胞因子的强烈表达，在感染早期达到高峰，随后逐步递减，同时发现，心脏组织病理变化减轻，表明固有免疫系统在早期心肌炎阶段的病理学改变中发挥了重要的作用。

在EV- 71的感染过程中，TLR9发挥了重要的作用。Hsiao等[11]发现EV- 71感染敲除TLR9的小鼠与野生型小鼠后，敲除TLR9的小鼠体内IFN- α、MCP- 1、TNF- α、IFN- γ、IL- 6和IL- 10等细胞因子的表达量明显降低，并表现出了更严重的神经症状和100%的死亡率。

1.2 RLR对肠道病毒的识别 RLRs组成了一个细胞质蛋白家族，其成员有RIG- Ⅰ、MDA5以及LGP2，RGI- Ⅰ主要识别短的双链RNA和含5′三磷酸的单链RNA；MDA5主要识别长的双链RNA。其中RGI- Ⅰ和MDA5含有两个N端的半胱氨酸招募结构域(Caspase- recruitment domains，CARDs)、解旋酶结构域以及一个C端的遏制结构域(Repressor domain，RD)，而LGP2没有CARD[12]。CARD的磷酸化作用在固有免疫反应中起到至关重要的作用[13,14]。RIG- Ⅰ、MDA5中的CARD作用于线粒体抗病毒信号转导蛋白(MAVS，又叫IPS- 1、VISA、Cardif)，从而使MAVS作用于下游的TRAF3和TBK1/IKKi复合物，并介导IRF3/7的磷酸化，最终激活产生Ⅰ型干扰素[15,16]。

在EV- 71、CVB3、PV感染过程中，MDA5发挥着重要的识别作用[17- 19]。Kuo等[20]利用EV- 71感染过表达MDA5的希拉细胞，发现IFN- β的表达量明显提高，并激活了原本被抑制的IRF3，这表明MDA5在EV71诱导IFN- β表达的过程起着关键性的作用。同样的作用也发生在CVB3的感染过程中:与正常小鼠相比，缺失MDA5的小鼠在感染CVB3后，其诱导Ⅰ型干扰素的能力受损，并伴有胰腺癌和肝坏死以及高死亡率[18]。

1.3 NLR对肠道病毒的识别 NLRs也是细胞内的模式识别受体之一，对病原微生物引起的感染可以产生固有免疫反应。某些NLRs可以被组装成较大结构的炎症小体，其中NLRP3(NOD- like receptor,pyrin domain containing 3)炎症小体最具研究价值。NLRP3炎性小体的激活有两个阶段[21]:首先是需要NLRP3的表达，例如病毒双链RNA、脂多糖等和细胞膜上的TLRs结合，激活NF- κB信号通路，从而诱导NLRP3的上调表达。其次，凋亡相关微粒蛋白ASC(Apoptosis- associated speck- like protein contai- ning CARD，ASC)发生泛素化以及磷酸化，并在激活刺激物(例如，线粒体活性氧的释放、溶酶体组织蛋白酶B的释放、K+外流等)的作用下，作为中间接头分子，结合NLRP3和pro- caspase- 1，组装成完整的炎症小体，使pro- caspase- 1发生自我蛋白酶解作用成为活化的caspase- 1，活化的caspase- 1切割IL- 1β、IL- 18的前体，产生相应成熟的细胞因子IL- 1β、IL- 18[2,4]。

NLRP3炎症小体在肠道病毒入侵过程也起着重要的作用。例如，EV- 71在细胞内复制过程中会激活NLRP3炎症小体，并产生IL- 1β，而NLRP3炎症小体缺失的小鼠在感染EV- 71后，表现出了更严重的坏死性心肌炎和更强烈的炎性细胞浸润，表明NLRP3炎症小体对EV- 71的感染有一定的抵抗作用[22]。同样，CVB3的感染也会激活NLRP3炎症小体，并在其诱导的病毒性心肌炎中发挥着重要的作用[23]。

2 肠道病毒逃避宿主固有免疫系统

尽管宿主的固有免疫系统对肠道病毒有强烈的抵抗力，但是许多肠道病毒进化出了一系列的逃避机制，破坏宿主的免疫反应，从而达到自身增殖的目的。主要通过以下几种方式来逃避宿主的免疫反应(图1)。

2.1 切割模式识别受体 病毒入侵宿主后，宿主的PRRs能够快速识别病毒核酸，如RGI- Ⅰ和MDA5通过CARD样结构和MAVS(又称IPS- 1、VISA、Cardif)相互作用，激活NEMO(又称IKKγ)和IKK相关激酶(IKK- α/β、TBK1)，随后激活下游的IRF- 3/7和NF- κB，这些转录因子进入到细胞核，激活Ⅰ型干扰素和炎性因子。研究发现[24- 26]，EV71和CVB3的2A蛋白能够直接切割MDA5，其3C蛋白可切割RIG- I、TRIF；同时发现，CV68的3C蛋白也能通过切割TRIF[27]，最终阻断干扰素反应。Xiang等[28]发现EV- D68的3C蛋白能够使IRF7发生裂痕，从而破坏了宿主Ⅰ型干扰素的表达和限制病毒增殖的能力，3C蛋白和IRF7的互作有利于病毒的复制。CVB3通过阻断TBK1的磷酸化，从而影响了下游干扰素及细胞因子的产生。Barral等[19]发现，PV感染细胞后，依赖半胱天冬酶和蛋白酶体降低了MDA5的表达，并猜测PV可能是通过割裂MDA5来阻断Ⅰ型干扰素的产生，Kotla等[29]进一步发现PV是通过锁定IRF- 3的激活，并不是割裂MDA5或者MAVS来抑制了IFN- Ⅰ的表达。EV- 71的3C蛋白通过切割TAK1/TAB1/TAB2/TAB3复合物，抑制NF- κB的激活，最终调控了Ⅰ型干扰素和细胞因子的表达[30]。EV- 71的2C蛋白与蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase 1，PP1)以及IKKβ形成一个复合物，从而抑制了IKKβ的磷酸化和NF- κB的激活，进一步研究发现，PV、CVA16、CVB3的2C蛋白也有相同的功能[31]。EV- 71的2A和3C蛋白还能够切割NLRP3，阻止炎症小体的激活，以达到自身增殖的目的[22]。

图1 肠道病毒逃避宿主固有免疫通路的方式(参照文献[2,15])Fig.1 Way of enterovirus evade host innate immune pathways(some ideas from these articles[2,15])

2.2 抑制干扰素信号传导通路 病毒通过调节Ⅰ型干扰素受体、JAK1、Tyk2、STAT1、STAT2和IRF9等主要信号通路来干扰和抑制干扰素信号传导通路，以达到自身增殖的目的。首先，宿主体内的干扰素会作用于一些信号通路中重要的成分，如JAK、STATs等，使细胞处于一种抗病毒的状态。而病毒抑制这些成分的激活，从而抑制了干扰素刺激基因的产生并逃避了干扰素的抗病毒作用。其次，Ⅰ型干扰素信号的激活需要干扰素诱导和适应性免疫反应，如细胞毒性T淋巴细胞和抗体的产生。因此，病毒通过抑制干扰素的信号传导也能够延迟或减少宿主固有免疫和适应性免疫的抗病毒反应[32]。Lu等[33]发现，EV71利用2A蛋白抑制了细胞内IFNAR1的表达，从而锁定了JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2的磷酸化，并中断了干扰素信号通路。然而，Liu等[34]发现，EV71并不能明显改变IFNAR1的表达，而是下调了JAK1的表达，从而抑制了细胞内的Ⅰ型干扰素的表达，但研究并未发现EV71的2A和3C蛋白抑制JAK1的表达，因此，肠道病毒阻断干扰素信号传导通路的具体抑制机制尚有待进一步研究。

3 展望

固有免疫系统作为机体的第一道防线，在抵抗微生物感染过程中发挥着举足轻重的作用，尤其是Ⅰ型干扰素反应。肠道病毒一直威胁着人类的健康和生产，一方面，宿主通过固有免疫部分系统抑制了肠道病毒的复制增殖；另一方面，肠道病毒在长期与宿主搏斗的过程中，进化出了一些逃避机制，例如，利用自身编码的2A、2C、3C等蛋白靶向作用于一些细胞内的信号蛋白，减弱其信号传导的功能，使自身得以生存，但是这些复杂的逃避机制还未完全被阐述清楚，如现在报道较多是肠道病毒的2A和3C蛋白对一些重要的接头分子有切割抑制作用，而其他非结构蛋白(3B、3D等)是否也有这样的作用，现在不得而知，需要后续研究进一步阐明。

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[收稿2017- 01- 09 修回2017- 03- 08]

(编辑 许四平 刘格格)

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10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.031

①本文为国家自然科学基金(31472223)和国家现代农业(水禽)产业技术体系专项(CARS- 43- 8)。

谢金炎(1993年-)，男，在读硕士，主要从事预防兽医学方面的研究，E- mail：xiejinyan1110@163.com。

及指导教师：程安春(1965年-)，男，博士，教授，主要从事动物传染病学的教学和研究工作，E- mail：chenganchun@vip.163.com。 汪铭书(1964年-)，女，博士，教授，主要从兽医微生物的教学和研究工作，E- mail：mshwang@163.com。

R392.12

A

1000- 484X(2017)08- 1263- 04

②同时供职于四川农业大学预防兽医研究所，成都611130。

③同时供职于四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，成都611130。