Compound 48/80活化的肥大细胞对树突状细胞归巢的影响①

任书荣 王秋波 张艳丽 路翠秀 李文丽 胡文娟

(青岛大学基础医学院免疫学系，青岛266071)

Compound 48/80活化的肥大细胞对树突状细胞归巢的影响①

任书荣 王秋波 张艳丽 路翠秀 李文丽 胡文娟

(青岛大学基础医学院免疫学系，青岛266071)

目的：检测compound 48/80(C48/80)活化的肥大细胞对树突状细胞(DC)向局部引流淋巴结迁移的影响，初步探讨C48/80增强适应性免疫应答的机制。方法：体外培养C57BL/6小鼠骨髓来源的DC(BM- DC)和MC/9肥大细胞，Transwell 趋化小室实验检测C48/80处理的MC/9细胞对BM- DC向趋化因子CCL21迁移的影响。甲苯胺蓝染色法检测小鼠肩背部皮肤注射C48/80后肥大细胞脱颗粒状态；流式细胞术检测肩上和腋窝淋巴结CD11c+DC的数量。小鼠肩背部两侧各注射荧光微球标记的BM- DC，制备局部引流淋巴结冷冻切片，荧光显微镜观察C48/80处理对外源性DC归巢的影响。采用负载卵白蛋白的BM- DC(OVA- DC)免疫C48/80处理及对照小鼠，WST- 8试剂检测局部引流淋巴结淋巴细胞的增殖活性。结果：采用小鼠骨髓细胞成功培养并获得大量典型的BM- DC。MC/9肥大细胞活化上清可促进BM- DC向CCL21迁移(P<0.01)。皮内注射C48/80后30 min可诱导局部皮肤明显肥大细胞脱颗粒。C48/80注射部位24 h出现明显炎细胞浸润，局部引流淋巴结细胞总数和DC细胞数量增多。注射荧光微球标记的BM- DC后48 h淋巴结冷冻切片显示C48/80处理侧荧光阳性的DC细胞数量明显多于C48/80未处理侧。OVA- DC免疫小鼠显示C48/80处理组抗原特异性淋巴细胞增殖能力较对照组明显增高(P<0.05)。结论：C48/80诱导的肥大细胞活化能够促进DC向局部引流淋巴结归巢，增强特异性淋巴细胞增殖能力，参与适应性免疫应答。

肥大细胞；Compound 48/80；树突状细胞归巢；淋巴细胞增殖

肥大细胞在病原体易于侵入机体的皮肤和黏膜部位含量较多，胞浆中含有大量嗜碱性颗粒，是引起哮喘、荨麻疹、花粉症等过敏性疾病的主要效应细胞[1,2]。研究发现多种细菌感染、接触性致敏和完全弗氏佐剂参与诱导的适应性免疫应答均需要肥大细胞参与[3- 5]。肥大细胞刺激剂或肥大细胞活化释放的颗粒及人工制备的颗粒类似物，已被作为潜在的免疫佐剂，应用于增强机体体液免疫应答的研究[6- 9]。Compound 48/80(C48/80)是一种由N- 甲基- 对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的小分子聚合物，可激发Gi- 蛋白依赖的肥大细胞脱颗粒，有效地诱导肥大细胞活化，研究表明C48/80可增强炭疽杆菌和甲型流感病毒肽类疫苗的黏膜免疫应答效果，具有良好的佐剂效应[6- 8,10,11]。免疫佐剂作用的机制复杂，包括改变抗原的物理性状，延缓抗原的降解；诱导炎症反应，吸引抗原提呈细胞到达炎症部位并使之活化，增强该类细胞对抗原的摄取加工；刺激淋巴细胞增殖分化，增强和扩大免疫应答等。C48/80增强免疫应答的具体机制尚需要进一步研究。

免疫系统功能的有效发挥需要多种细胞的参与，涉及多种细胞之间的直接接触和通过可溶性介质发挥作用。树突状细胞(Dendritic cell，DC)作为体内功能最强大的抗原提呈细胞，可摄取、加工和处理抗原，并将抗原信息提呈给T淋巴细胞，启动适应性免疫应答[12,13]。肥大细胞和DC均存在于病原体及其他外源性因子易于入侵的外周皮肤和黏膜部位，可通过模式识别受体识别外源性异物参与早期固有免疫应答。肥大细胞活化后可释放TNF、IL- 1、组胺、白三烯类、PGE2 等生物活性介质，这些物质与诱导DC成熟和迁移有关[14]，而DC的迁移和成熟是适应性免疫应答的关键步骤，故肥大细胞活化可通过作用于邻近的DC影响适应性免疫应答的强度和类型。动物实验表明细菌感染和免疫复合物介导的肥大细胞活化可诱导皮肤DC向DLN 归巢[3,15]。本研究通过体内外实验检测C48/80活化的肥大细胞对DC向局部引流淋巴结归巢的影响，初步探讨C48/80影响适应性免疫应答的机制。

1 材料与方法

1.1 动物和主要试剂 清洁级C57BL/6小鼠，雌性，8～10周龄，购自青岛市派特福德动物养殖专业合作社。Compoud48/80(C48/80)购自Sigma aldrich公司。重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte- macrophage colony- stimulating factor,GM- CSF)和IL- 4购自PeproTech公司。荧光微球购自Polysciences公司。细胞增殖试剂盒购自上海七海福泰生物科技有限公司。FITC- 抗小鼠CD11c购自eBioscience。胶原酶 D 购自Roche公司。LPS、鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)购自Sigma Aldrich。RPMI1640培养液购自Hyclone，胎牛血清购自Gibco。24孔板趋化小室为Corning Costar产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 来自小鼠胎儿肝脏的肥大细胞系MC/9细胞在含有10%大鼠T细胞刺激上清(Rat T- STIM)、100 ml/L胎牛血清、100 000 U/L 的青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM液体中培养，2×106ml-1MC/9细胞与10 μg/ml C48/80 37℃孵育30 min，离心取上清用于BM- DC趋化实验。无菌取小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，红细胞裂解液裂解红细胞后，用含10 μg/L GM- CSF、10 μg/L IL- 4、100 ml/L 胎牛血清、50 μmol/L 2- 巯基乙醇、100 000 U/L 的青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640营养液培养骨髓源性的树突状细胞，第6天加入20 μg/L LPS，第7天用于BM- DC趋化实验和体内迁移实验。取部分LPS诱导后细胞进行FITC- CD11c荧光抗体染色，流式细胞术检测培养细胞中BM- DC纯度。

1.2.2 BM- DC趋化实验 采用滤膜孔径为5 μm的24孔板趋化小室进行实验。下室孔中分别加入含或不含100 μg/L CCL21的测定液(RPMI1640+0.1%BSA)600 μl，上层小室中分别加入BM- CD及各种不同稀释度(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80)的MC/9细胞活化上清液的BM- DC(5×105in 100 μl)，37°C，2 h。对迁移至下层小室的细胞进行计数。每个实验重复测定3次。向CCL21特异性趋化的BM- DC数=该组全部迁移的细胞数-自发迁移组(下层小室无CCL21)的细胞数。

1.2.3 C48/80诱导局部皮肤肥大细胞脱颗粒模型的建立 取C57BL/6小鼠3只，水合氯醛腹腔注射麻醉，肩上背部皮肤剃毛，分别取50 μl 0.5 g/L，C48/80或50 μl生理盐水(NS)皮下注射，分别于30 min、4 h、24 h取注射局部皮肤，制备石蜡切片，酸化甲苯胺蓝染色。每切片于普通光学显微镜下观察10个高倍视野，计数正在脱颗粒肥大细胞总数。

1.2.4 内源性DC迁移检测 水合氯醛麻醉小鼠，肩上背部皮肤剃毛，左侧皮下注射25 μg C48/80，右侧注射相同体积的生理盐水作为对照。24 h后取腋窝和肩上淋巴结，去除脂肪和筋膜，2.7 g/L胶原酶 D消化淋巴结细胞，细胞筛过滤以获取单个细胞悬液。细胞计数后用各组细胞采用FITC- 抗小鼠CD11c进行染色，流式细胞仪检测染色后标本，DLN中CD11c+DC总数=CD11c+细胞百分率×DLN细胞总数。

1.2.5 外源性DC细胞迁移实验 培养第5天的BM- DC加入荧光微球孵育过夜，第6天加入20 μg/L LPS，第7天用于BM- DC体内迁移试验。第6天麻醉后小鼠肩背部左侧皮内注射50 μl 0.5 g/L C48/80，右侧注射50 μl NS作为对照，第7天两侧皮内均注射荧光微球标记的BM- DC 1×106/50 μl。48 h 断颈处死小鼠，分离肩上淋巴结。迅速冷冻包埋于OCT包埋液中。-80℃保存备用。恒温冷冻切片机切片，厚度8 μmol/L，4%PFA固定10 min，荧光显微镜下观察切片中黄绿色荧光阳性的BM- DC。

1.2.6 淋巴细胞增殖能力检测 培养第5天的BM- DC加入终浓度为100 mg/L的鸡卵白蛋白孵育过夜，制备负载卵白蛋白的BM- DC(OVA- DC)，第6天加入20 μg/L LPS，第7天收获细胞，分别皮内注射C48/80预处理24 h的小鼠和NS预处理的对照组小鼠各5只。间隔1周时间重复免疫1次。于末次免疫后7 d取两组小鼠肩背部、腋窝淋巴结，制备单细胞悬液。用含10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为2.5×106ml-1，分别加入96孔板各孔，每孔100 μl，同时设只加1640培养液孔作为空白对照。特异性刺激组细胞分别加入100 mg/L OVA 100 μl，对照组加入100 μl 1640培养液。每次测定均设4复孔，每孔终体积为200 μl。将培养板置于37℃，5%CO2培养箱培养72 h，每孔加入CCK8试剂20 μl继续培养4 h，酶标仪检测各孔450 nm处吸光度值(OD)。淋巴细胞刺激增殖能力以(测定组OD-空白对照OD)表示。

2 结果

2.1 BM- DC 培养及鉴定 本课题采用小鼠重组GM- CSF和IL- 4诱导骨髓前体细胞向树突状细胞方向分化，经过7 d培养成功获得典型的树突状细胞。骨髓细胞培养至第3～5天时，可见较多由数个细胞形成的细胞集落，随时间推移每个细胞集落体积变大，细胞数量增多，可见明显毛刺样突起(图1A)。培养至第6～7天时，可见较多散在典型游离树突状细胞(图1B)。流式细胞术测定结果显示培养细胞中CD11c+DC细胞的比例可达77.4%(图1C)。

2.2 MC/9肥大细胞活化释放的活性介质可促进BM- DC向CCL21趋化 MC/9细胞系为来自于小鼠胎儿肝脏的肥大细胞，悬浮生长。在Rat T- STIM存在的情况下可长期传代培养。MC/9细胞在C48/80的作用下可被活化，脱颗粒释放生物活性介质入上清液中[16]。成熟的BM- DC和活化的MC/9上清液共同作用后，向CCL21迁移的数量较对照组细胞明显增多，迁移的细胞数与加入的活化肥大细胞上清液的量呈正相关，1∶80稀释的上清液即可有效的促进BM- DC迁移(表1)。

2.3 C48/80可诱导皮肤肥大细胞脱颗粒和炎症反应 组织中的肥大细胞胞质中含有大量嗜碱性颗粒，易溶于水，HE染色不易观察，但颗粒具有异染性，可被甲苯胺蓝染料染色呈紫红色，在组织中易于辨认(图2)。未脱颗粒的肥大细胞呈椭圆形、梭形或不规则，轮廓清晰，胞质染色较深，细胞周围无明显颗粒脱出；正在脱颗粒的肥大细胞失去原有形态，胞浆染色变浅，细胞周围可见散在颗粒；完全脱颗粒的肥大细胞较难辨认。生理盐水处理组小鼠皮肤表皮下存在较多胞质颗粒完整的肥大细胞，正在脱颗粒肥大细胞较少。注射C48/80后30 min，局部组织出现较多正在脱颗粒的肥大细胞，脱颗粒肥大细胞数量在C48/80处理后4 h进一步升高，24 h出现下降趋势，但仍高于对照组。C48/80皮下注射后24 h，局部组织伴有明显的炎细胞浸润。

图1 骨髓来源的树突状细胞的扩增培养和鉴定Fig.1 Prapagation and identification of bone marrow derived dendritic cellsNote: A.Typical BM- DC colony on day 6 in culture(×400);B.Typical single cell on day 7 in BM- DC culture(×400);C.CD11c expression on BM- DC detected by flow cytometry.

GroupsSpecificmigratedcells(×104)BM-DC5.0±1.8BM-DC+MC(1∶80)13.0±1.51)BM-DC+MC(1∶40)19.4±2.12)BM-DC+MC(1∶20)20.6±3.32)BM-DC+MC(1∶10)24.8±1.82)

Note：1)P<0.01，2)P<0.001 vs BM- DC group.

2.4 C48/80可诱导DLN增大和DC数量增多 为了检测C48/80注射对DLN的影响，我们对C48/80注射后不同时间点肩上和腋窝淋巴结的大小和细胞数目进行了观察和测定。结果表明C48/80注射后DLN体积增大(图3)；DLN细胞总数随C48/80处理后时间的推移逐渐增多，24 h达到最高峰，大约为NS对照组DLN细胞数的4倍；48 h时细胞总数较24 h时有所降低，但仍高于对照组；流式细胞术检测结果表明淋巴结中CD11c+DC细胞数量亦逐渐增多，CD48/80注射后24 h淋巴结中DC细胞数可达NS处理组细胞数的6倍(表2)。

2.5 C48/80处理局部皮肤可促进外源BM- DC向引流淋巴结归巢 小鼠局部皮肤注射C48/80后24 h，注射荧光微球标记的BM- DC，于DC注射后48 h取DLN用荧光显微镜和FACS检测BM- DC迁移。荧光显微镜下可见C48/80处理侧淋巴结冰冻切片较对照侧具有更多发出黄绿色荧光的BM- DC(图4A、B)。FCM结果证实C48/80处理侧归巢至DLN的外源BM- DC细胞数与对照侧比较明显增多，平均增多比例68.2%(图4C)。

图2 甲苯胺蓝染色法检测肩背部皮肤肥大细胞

Fig.2 Scapular skin mast cell detection by toluidine blue staining method

Note: A.Mast cells in the skin after NS injection(×100);B.Mast cells in the skin after C48/80 injection(×100);C.Number of degranulating mast cells at indicated time after C48/80 injection.*.P<0.05;***.P<0.001 vs.control.

图3 C48/80或NS注射肩背部皮肤24 h肩上(上)和腋窝(下)LN形态Fig.3 Gross morphology of draining brachial(upper) and axillary(lower) lymph nodes 24 h after C48/80 or saline injection

图4 局部皮肤注射荧光微球标记的BM- DC后48 h向 DLN归巢的检测 (n=12)

Fig.4 Detection of BM- DC homing to DLN 48 h after green- microbeads labeled cells were injected into scapular skin(n=12)

Note: A.Representative image of DLN from C48/80 pretreated mice;B.Image of DLN from NS pretreated mice;C.Number of BM- DC in DLN.*.P<0.05 vs.control.

表2 C48/80处理后不同时间点DLN细胞总数和DC细胞的变化(n=3～5)

Tab.2 Total cell and dendritic cell number in draining lymph nodes at indicated time following C48/80 injection(n=3-5)

CelltypeControlC48/8030minC48/804hC48/8024hC48/8048hNumberoftotalcellsinDLNs(×106)4.3±0.45.3±0.51)6.9±0.82)16.1±1.52)12.5±1.02)NumberofDCsinDLNs(×104)5.6±0.66.9±0.61)9.3±1.92)34.9±4.52)30.7±5.11)

Note：1)P<0.05;2)P<0.001 vs.control.

图5 WST- 8试剂检测淋巴结细胞增殖能力Fig.5 DLN lymphocyte proliferation assay by WST- 8 reagentNote: **.P<0.01;***.P<0.001.

2.6 OVA- pulsed BM- DC免疫C48/80处理小鼠表现为更强的特异性淋巴细胞增殖 OVA- pulsed BM- DC 分别免疫C48/80 及NS预处理的小鼠2次，分离DLN，采用MTS- 8试剂检测小鼠淋巴结细胞的增殖能力，结果显示两组小鼠淋巴结细胞加入卵白蛋白刺激后增殖能力较未刺激组均明显增强；C48/80预先处理组较未用C48/80免疫组表现为更强的特异性淋巴细胞增殖，差异具有显著统计学意义(P<0.01，图5)。

3 讨论

本课题采用含重组小鼠细胞因子GM- CSF和IL- 4的营养液成功培养获得形态典型的BM- DC，75%以上细胞表面表达CD11c，为体外研究DC迁移和DC疫苗免疫效果奠定了基础。本研究发现LPS诱导成熟的BM- DC和活化的MC/9上清液共同作用后，向CCL21迁移的数量较对照组细胞明显增多，迁移的细胞数与加入的活化肥大细胞上清液的量呈正相关，表明MC/9肥大细胞活化上清中含有促进BM- DC向CCL21迁移的活性物质。动物实验显示局部皮肤经C48/80处理后表现为明显的肥大细胞脱颗粒(图2)，DLN DC细胞数较对照组明显增多(表2)，C48/80亦可促进外源性输入的BM- DC向DLN迁移。DC从外周组织沿淋巴管道向淋巴结迁移受趋化因子受体和相应配体、黏附分子、基质金属蛋白酶和脂类介质等多种因素调控，其中趋化因子受体CCR7及其配体CCL19和CCL21在DC归巢中起关键作用[13,17,18]。肥大细胞活化释放的多种可溶性介质具有促进DC归巢的潜能，其中TNF- α可促进DC CCR7表达，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)和半胱氨酰白三烯(Leukotrienes,LTs)可增加CCR7对配体的敏感性[19]，何种介质作用较强需要进一步研究。

对接触性致敏动物模型的研究发现肥大细胞参与皮肤DC迁移和成熟，在适应性免疫应答的活化和效应阶段发挥作用[4,20]。在二硝基氟苯(DNFB)诱导的接触性致敏阶段，肥大细胞分泌的TNF可促进CD8+DC向DLN迁移，增强CD8+T细胞参与的免疫应答，引起局部皮肤T细胞、中性粒细胞浸润和水肿[20]。体外实验发现骨髓来源的肥大细胞以依赖ICAM和TNF的方式促进BM- DC活化、成熟和迁移，活化的BM- DC通过直接接触促进肥大细胞钙离子内流，上调肥大细胞膜型TNF的表达，进一步促进DC功能的发挥，证实肥大细胞在异硫氰基荧光素(FITC)诱导的接触性超敏反应的致敏阶段发挥作用[4]。肥大细胞活化后释放的颗粒，可迅速到达DLN，颗粒中的TNF可缓慢释放，在诱导DLN肿大方面发挥重要作用[21]。本研究发现局部皮肤注射C48/80后可诱导局部明显的肥大细胞脱颗粒和炎性细胞浸润，DLN体积增大和细胞数量增多，与文献报道结果一致[21,22]。

体外制备的DC疫苗可增强机体抗感染和抗肿瘤能力，C48/80作为潜在的DC疫苗免疫佐剂可进一步增强DC疫苗的免疫应答效果。本研究发现负载卵白蛋白的DC(OVA- DC)输入C48/80处理的小鼠体内，淋巴结细胞对卵白蛋白刺激的反应能力增强，表明C48/80可增强OVA- DC疫苗的免疫应答效果，其作用机制可能与C48/80促进DC向DLN迁移增多有关。DLN中DC数量增多，有利于与初始T细胞接触，诱发适应性免疫应答的发生[23]。肥大细胞活化释放的活性物质复杂，诱导机体以Th2型免疫应答为主[24,25]。体内肥大细胞在IgE介导的活化后通过组胺依赖的机制诱导LC迁移至DLN，诱导Th向Th2方向分化，加重超敏反应的发生[15]。小鼠鼻腔内同时应用C48/80和OVA能促进机体产生IgE、IgG和IL- 4，过敏症状明显。然而鼻内应用C48/80和炭疽杆菌保护性抗原肽PA可诱导机体IgA和IgG产生[7]，未发生明显过敏反应。因此在以C48/80为佐剂的研究中应注意过敏反应发生的可能性，本研究发现小鼠局部注射25 μg C48/80，处理局部仅表现为轻微瘙痒，未见其他的明显过敏反应症状如竖毛、腹泻等，表明该剂量的C48/80可被小鼠耐受。

总之，C48/80诱导的肥大细胞活化能够促进DC向DLN归巢，增强特异性淋巴细胞增殖能力，参与适应性免疫应答。该实验结果为进一步应用C48/80作为疫苗佐剂促进多种抗原肽疫苗或DC疫苗的免疫应答效应提供理论依据。

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[收稿2017- 01- 05]

(编辑 倪 鹏)

Impact of compound 48/80 activated mast cell on dendritic cell homing to lymph nodes

REN Shu- Rong,WANG Qiu- Bo,ZHANG Yan- Li,LU Cui- Xiu,LI Wen- Li,HU Wen- Juan.

Department of Immunology,Basic Medical College of Qingdao University,Qingdao 266071,China

Objective:To investigate the effect of compound 48/80(C48/80) activated mast cell on dendritic cell homing to draining lymph nodes(DLN) in order to explore the potential mechanism of C48/80 promoting adaptive immune response.Methods: C57BL/6 mice bone marrow derived dendritic cells(BM- DC) and MC/9 mast cell line were propagated in vitro.Chemotaxis of BM- DC supplemented with supernatant of C48/80 treated MC/9 to CCL21 was measured by transwell chemotaxis assay.C48/80 was injected into murine scapular site,local skin mast cell degranulation was detected by toluidine blue staining method.The number of CD11c+DC in draining lymph nodes(DLN) was detected by Flow cytometry.Exogenous green microbeads labeled BM- DC homing to DLN was detected by fluromicroscope.The mice pretreated with or without C48/80 were vaccinated by ovalbumin pulsed DC(OVA- DC),DLN lymphocyte proliferation was detected by WST- 8 reagent.Results: A large amount of typical BM- DC were harvested from media supplemented with murine recombinant IL- 4 and GM- CSF.Product of activated MC/9 enhanced chemotaxis of BM- DC to CCL21(P<0.01).Intradermal injection of C48/80 induced local mast cell obvious degranulation and local inflammation.Mice pretreated with C48/80 demonstrated high number of total cells and DC cells in DLN.The number of fluorescent positive BM- DC in DLN also increased in C48/80 pretreated mice.Antigen specific lymphocyte proliferation enhanced in OVA- DC inoculated C48/80 pretreated mice.Conclusion: Mast cell activation induced by C48/80 can enhance DC homing to DLN and increase specific lymphocyte proliferation,which may be one of a mechanism of C48/80 in promoting adaptive immune response.

Mast cell;Compound 48/80;Dendritic cell homing;Lymphocyte proliferation

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.005

①本文受山东省自然科学基金(ZR2014HM025)资助。

任书荣(1973年-)，女，博士，讲师，主要从事细胞免疫和肿瘤免疫的研究，E- mail: renshurongsd@163.com。

R392.12

A

1000- 484X(2017)08- 1146- 06