1,25(OH)2VD3对大鼠肺纤维化中IL- 9及PU.1表达水平的影响①

郑 静 刘乃国 倪 娜 董洪亮 王 楠 成苗青

(滨州医学院附属医院临床医学实验室,滨州256603)

1,25(OH)2VD3对大鼠肺纤维化中IL- 9及PU.1表达水平的影响①

郑 静 刘乃国 倪 娜 董洪亮 王 楠 成苗青

(滨州医学院附属医院临床医学实验室,滨州256603)

目的：探讨肺纤维化发生发展中IL- 9及PU.1的作用以及活性维生素D3[1,25(OH)2VD3]在纤维化过程中对两种因子表达水平的影响。方法：90只SPF级雄性SD大鼠随机分成三个组：对照组、模型组和治疗组(n=30)。模型组和治疗组经气管注入博来霉素(5 mg/kg)建立肺纤维化模型，对照组注入等体积生理盐水。治疗组于手术后第2天腹腔注射活性维生素D3，模型组注射等量的活性维生素D3溶剂(丙二醇)，对照组注射等量的生理盐水。各种处理均为两天一次。分别于手术后第14、21和28天处死大鼠取材，各小组每个时间点10只大鼠。HE染色法观察各组实验大鼠肺部病理变化，Masson染色法观察胶原纤维的差异，碱水解法检测羟脯氨酸含量的变化。应用Real- time PCR和免疫组化技术分别从mRNA水平和蛋白质水平检测大鼠肺组织中IL- 9及PU.1的表达，ELISA法检测血清中IL- 9的表达水平。结果：博来霉素处理后，第14天大鼠肺部已经出现纤维化，随着时间推移，纤维化进一步加重。在三个时间点，模型组和治疗组的羟脯氨酸含量明显高于对照组，而治疗组明显低于模型组。在三个时间点，治疗组和模型组中IL- 9及PU.1的表达量均逐渐增高，且都显著高于对照组；第14、21天治疗组两种因子的表达量均明显低于相应时间点的模型组,第28天时治疗组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。第21天模型组和治疗组IL- 9和PU.1的表达水平明显高于第14天，第28天与第21天比较差异无统计学意义。结论：IL- 9和PU.1在博来霉素引起的大鼠肺纤维化早期可能发挥促纤维化作用。活性维生素D3可能通过降低PU.1的表达水平，进而减少IL- 9的分泌，从而对大鼠肺纤维化的发生发展起一定的抑制作用。

肺纤维化；活性维生素D3；IL- 9；PU.1

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)，以弥漫性肺实质、肺泡炎症和间质纤维化为基本病理病变。目前该病发病机制尚不完全清楚，也缺乏有效的治疗措施。因此探讨其发病机制，寻找有效的治疗方法具有重要意义。研究发现活性维生素D3(VD3)具有抑制小鼠肺纤维化的作用[1,2]。IL- 9(Interleukin9，IL- 9)是一种T细胞产生的细胞因子，其靶标细胞包括淋巴细胞、骨髓细胞、肥大细胞等，在自身免疫疾病的发生中具有重要作用[3]。小鼠中的IL- 9过度表达与肺纤维化的发展和发病率有关[4,5]。Chang等[6]通过实验证实PU.1可以特异性地增强Th9细胞表型，为Th9特异转录因子。最近研究证实Th9细胞通过PU.1与其他因子的相互作用参与了大鼠肺纤维化的过程[7,8]。本实验旨在探讨由博来霉素诱导的大鼠肺纤维化发生发展过程中，IL- 9和PU.1的作用以及活性VD3对IL- 9和PU.1的影响，为阐明发病机制，探索有效治疗方法提供科学资料。

1 材料与方法

1.1 材料 90只6～8周龄SPF级雄性 SD大鼠购自山东鲁抗医药有限公司，动物合格证号：SCXK (沪)2008- 0016，体重为(200±20)g。博来霉素为日本化药株式会社产品(15 mg/支，批号：030201),活性维生素D3[1,25(OH)2VD3，批号：#074M4028V]购自美国Sigma公司，PU.1小鼠抗大鼠抗体 (C- 3)(sc- 390405)购自Santa公司，IL- 9抗体(ab203386)购自Abcam公司，小鼠超敏二步法检测试剂盒，兔超敏二步法检测试剂盒等购自北京中杉金桥公司，外周血RNA提取试剂盒购自大连TaKaRa 生物技术公司(No9112/9113)，肺组织RNA提取试剂盒购自OMEGA公司，HiFiScript快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒购自康为世纪生物技术公司，实时Real- time- PCR试剂盒购自Roche公司，大鼠 IL- 9 ELISA检测试剂盒购自上海生工(C506549)，羟脯氨酸(HYP)测定试剂盒(碱水解法)购自南京建成生物工程研究所(A030- 2)。引物和大鼠GAPDH内参引物(B661204- 0001,10 μmol/L,100 μl)由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组 90只大鼠饲养于SPF级环境中，按随机数字表法分为3组：对照组(生理盐水+生理盐水)、模型组(博来霉素+丙二醇)、治疗组(博来霉素+活性VD3)。4%水合氯醛(10 μl/g)腹腔注射麻醉后，气管滴注博来霉素5 mg/kg。对照组相同手术后气管内注入等体积的生理盐水。造模后自第2天起,治疗组每两天腹腔注射用丙二醇稀释的活性VD3(2 μg/kg)给予治疗，模型组腹腔注射等体积的丙二醇，对照组腹腔注射等体积的生理盐水。各组术后第 14、21、28天各处死10只大鼠。处死前心脏穿刺取血2 ml，1 ml置于EDTA- K2抗凝管中，以供提取RNA；另1 ml置于促凝管中，分离血清。取右肺下叶用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学染色和病理染色；左肺下叶提取RNA，其余肺组织液氮速冻用于羟脯氨酸含量测定。

1.2.2 病理检测 HE染色法观察各组实验大鼠肺部病理变化，Masson染色法观察胶原纤维的差异。

1.2.3 HYP测定 将肺组织在液氮中捣成粉末，按100 mg粉末加入1 ml生理盐水的比例制备组织匀浆，按照 HYP试剂盒说明书操作，碱水解法及分光光度计法检测肺组织HYP含量。

1.2.4 血清中IL- 9水平的检测 心脏穿刺取血1 ml 置于促凝管中，自然凝固后4 000 r/min离心5 min，取血清，-20℃贮存，待测。按ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 Real- time PCR检测血液和肺组织PU.1 mRNA的表达水平 (1)按试剂盒说明书分别提取血液和肺组织总RNA。(2)反转录：按反转录试剂盒说明书，各组取1 μg总RNA应用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，-80℃冰箱保存备用。(3) 荧光定量PCR：按照FastStart Essential DNA Green Master说明配制反应混合物，反应体系为20 μl，反应条件：95℃ 10 min，95℃ 10 s，65℃ 10 s，72℃ 15 s，重复40个循环；65℃至95℃，5 s增加0.5℃，制备熔解曲线。每个样品设3个复孔。Spi1引物序列：上游5′- ACCTTCCAGTTCTCGTCCAA- 3′,下游5′- CCGTCTTGCCGTAGTTGC- 3′，产物长度124 bp。相对mRNA水平以2-ΔΔCT方法表示。

1.2.6 肺组织IL- 9、PU.1蛋白的检测 石蜡切片脱蜡水化后，0.3%H2O2处理内源性过氧化氢酶，抗原热修复，封闭液封闭后，分别滴加IL- 9、PU.1抗体(均按1∶100倍稀释)。37℃孵化30 min，4℃过夜。加入生物素二抗，室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作阴性对照。阳性信号为棕黄色着色。在光镜 10×40 放大倍数下每点随机摄片3张，应用病理图像分析系统(麦克奥迪数码医学图像分析系统)做半定量分析，以每例所有图片的平均吸光度值的算术平均值作为最终平均吸光度值。

2 结果

2.1 实验各组肺组织病理观察 肺组织切片HE染色结果：对照组肺泡结构正常，肺泡腔内无炎症细胞浸润。在三个时间点，模型组肺泡炎由重至轻，而肺纤维化由轻至重，成纤维细胞逐渐增多；肺泡腔内有巨噬细胞和中性粒细胞渗出，肺泡间隔充血增厚，肺泡结构破坏。治疗组也出现从肺泡炎到纤维化的变化过程，但较模型组轻(见图1A1～I1)。

肺组织切片Masson染色结果：胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，肌纤维、纤维素呈红色，胞核黑蓝色。对照组局部肺泡间隔稍增厚，少量胶原纤维存在于支气管壁周围。在三个时间点，模型组胶原纤维明显逐渐增多，肺泡结构破坏逐渐加重，肺泡间隔逐渐增厚，肺纤维化程度逐渐加重。治疗组与同一时间点的模型组相比，肺泡结构破坏稍轻，胶原纤维含量稍降低，纤维化程度稍轻，说明活性维生素D3对肺纤维化的发生和发展有一定的抑制作用(见图1A2～I2)。

2.2 不同时间各组肺组织羟脯氨酸含量测定 不同时间点，各组肺组织羟脯氨酸含量检测结果显示，模型组均明显高于对照组(P<0.01)，且随建模时间延长而逐渐增高；治疗组均明显低于相应时间点的模型组(P<0.05)。组内比较可见，模型组羟脯氨酸含量在第21天和28天均明显高于第14天(P<0.01)，第28天高于第21天(P<0.05)；治疗组在第21天和28天均高于第14天(P<0.05，P<0.01)，见表1。

2.3 血清IL- 9的浓度测定 造模手术后，随着时间的延长，模型组和治疗组血清IL- 9的水平均逐渐增高，且均高于对照组，而对照组在各时间点没有明显变化；治疗组在第14天、21天时血清IL- 9的水平均明显低于相应时间点的模型组(P<0.05)，而第28天时治疗组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；组内比较可见，模型组和治疗组IL- 9含量第21天明显高于第14天(P<0.05)，第28天高于第21天(P<0.05，见图2)。

图1 肺组织切片HE和Masson染色结果(×200)Fig.1 HE and Masson staining results of lung tissues slices(×200)Note: A1，B1，C1/D1，E1，F1/G1，H1，I1.HE staining results in control/model/treatment group on the 14th,21st and 28th day;A2，B2，C2/D2，E2，F2/G2，H2，I2.Masson staining results in control/model/treatment group on the 14th,21st and 28th day.

Groups 14d21d28dControl481±102452±127475±129 Model832±1371)1025±741)5)1182±751)5)7)Treatment650±702)3) 820±1281)3)6)858±851)4)5)

Note：Compared with control,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with model,3)P<0.01,4)P<0.05;compared with 14 d,5)P<0.01,6)P<0.05;compared with 21 d,7)P<0.05.

GroupsLungtissue14d21d28dBlood14d21d28dControl1.046±0.3511.073±0.0471.167±0.2121.068±0.0341.060±0.0421.053±0.028Model1.725±0.1531)2.744±0.1591)5)2.840±0.2561)1.614±0.0591)2.799±0.1022)6)2.827±0.1461)Treatment1.477±0.0622)4)2.142±0.4001)4)6)2.402±0.0661)3)1.410±0.0201)3)2.325±0.0891)4)5)2.372±0.3651)

Note：Compared with control,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with model,3)P<0.01,4)P<0.05;compared with 14 d,5)P<0.01,6)P<0.05.

GroupsIL-914d21d28dPU.114d21d28dControl0.634±0.0450.614±0.0450.632±0.0680.649±0.0270.665±0.0460.640±0.108Model0.758±0.0371)0.879±0.0551)5)0.898±0.0591)0.840±0.0091)1.017±0.0941)5)1.200±0.1881)Treatmant0.703±0.0032)4)0.813±0.0411)4)5)0.851±0.0191)0.809±0.0211)4)0.853±0.0321)3)5)0.896±0.1261)

Note：Compared with control,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with model,3)P<0.01,4)P<0.05;compared with 14 d,5)P<0.01.

图2 各组血清中IL- 9的浓度Fig.2 Concentration of IL- 9 in serum in each group±s)Note: Compared with control,*.P<0.01,#.P<0.05;compared with model,△.P<0.01;compared with 14 d,▽.P<0.05;compared with 21 d,☆.P<0.05.

2.4 肺组织和血液中PU.1 mRNA水平检测 不同时间点，肺组织和血液PU.1 mRNA水平检测显示，模型组和治疗组均明显高于对照组，且随建模时间延长而逐渐增高；治疗组第14天和21天均明显低于相应时间点的模型组；第28天时治疗组PU.1 mRNA含量只有肺组织中明显低于模型组(P<0.01)，血液中治疗组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。组内比较可见，第21天时模型组和治疗组肺组织及血液PU.1 mRNA水平均明显高于第14天，而第28天与第21天比较差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

图3 免疫组织化学DAB染色显示IL- 9和PU.1在肺组织中的表达(×400)Fig.3 IL- 9 and PU.1 expression by DAB immunoh- istochemical staining in lung tissues(×400)Note: A1，B1，C1/D1，E1，F1/G1，H1，I1.IL- 9 expression in control/model/treatment group on the 14th,21st and 28th day;A2，B2，C2/D2，E2，F2/G2，H2，I2.PU.1 expression in control/model/treatment group on the 14th,21st and 28th day.

2.5 肺组织IL- 9和PU.1免疫组化检测结果 肺组织IL- 9和PU.1蛋白主要表达在巨噬细胞、淋巴细胞的细胞质和部分细胞核内(见图3)。经图像分析量化后，在第14、21和28天三个时间点，模型组和治疗组肺组织IL- 9和PU.1的蛋白质表达水平均明显高于对照组，且随造模时间延长而逐渐增高；在第14天和21天，治疗组中两种因子的蛋白质表达均明显低于相应时间点的模型组中的表达，而第28天时治疗组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。组内比较可见，第21天时模型组和治疗组肺组织IL- 9和PU.1的蛋白表达水平明显高于第14天，而第28天与第21天比较差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。Spearman相关分析表明，肺组织中IL- 9蛋白质表达与PU.1 蛋白表达量之间表现为正相关(r=0.846,P<0.01)。

3 讨论

Moeller等[9]研究发现，大鼠气管内滴入博来霉素以后，首先发生急性炎症反应，持续8 d左右，自第9天发生纤维化改变一直持续到第28～35天。与本研究动物模型病变发生情况相一致。本研究通过HE染色病理结果和Masson染色结果表明，与同一时间点的模型组相比，治疗组肺泡结构破坏较轻，胶原纤维含量明显降低，纤维化程度较低。羟脯氨酸含量检测是判断肺纤维化程度的金标准。在各时间点，模型组肺组织羟脯氨酸含量均明显高于对照组，且随建模时间延长而逐渐增高，说明模型组羟脯氨酸含量呈逐渐上升趋势，反映了大鼠肺纤维化的程度随时间推移而加重。这与以往文献报道的肺纤维化模型相一致[10]。而且治疗组羟脯氨酸含量均明显低于相应时间点的模型组。以上研究结果同时提示活性VD3对大鼠肺纤维化的发生、发展有一定抑制作用。

IL- 9是一种T细胞产生的细胞因子，研究证实Th2、Th9 和 Th17等T细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞等均可产生 IL- 9[11]。Jiang等[12]研究发现IL- 9在结缔组织病伴间质性肺疾病(CTD- ILD)中的异常表达与肺纤维化的严重程度有关，且血清中IL- 9的水平明显高于健康对照组[12]。Evans[13]研究哮喘患者发现IL- 9过度表达损伤肺功能[13]。Steenwinckel等[14]研究发现肺部损伤的机制可能与高表达的IL- 9增加了气道上皮细胞黏液的分泌有关，而气道上皮细胞与气道的高反应性有关[14]。在链格孢属慢性滴注模型中，IL- 9能够加剧气道纤维化，但对纤维化的发展可能是可有可无的[15,16]。van den Brle[4]利用慢性暴露在互隔交链孢霉提取物的方法制作了Tg5(IL- 9过表达小鼠)哮喘模型,发现IL- 9有促进气道纤维化的作用。综合以上研究结果我们推测，在肺纤维化的过程中IL- 9很可能起了促进作用。本实验中大鼠血清IL- 9的浓度测定结果和IL- 9肺组织免疫组化结果同时显示，三个时间点模型组IL- 9蛋白水平均明显高于对照组，且随建模时间延长而逐渐增高。此测定结果支持IL- 9的促纤维化作用，与上述诸多研究结果相符。最近研究发现活性VD3对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化有抑制作用[1,2]。本研究结果显示，治疗组IL- 9的水平在第14、21天均明显低于相应时间点的模型组且呈逐渐增高趋势，第28天虽然也低于第21天但差异无统计学意义(P>0.05)，表明活性VD3治疗后IL- 9水平在肺纤维化发生的早期阶段明显降低了，提示活性VD3在纤维化发生的早期阶段(即第14天和21天)可能通过抑制IL- 9的表达发挥一定的抗纤维化作用；但是在后期阶段(即第28天)此抑制作用减弱或消失，具体原因有待于进一步研究。

二氧化硅诱导的小鼠肺纤维化模型中，过表达的IL- 9有抗肺泡纤维化的作用，并且IL- 9减轻的肺纤维化与B淋巴细胞群落的扩增有关[5,17]。在Tg5(IL- 9过表达小鼠)气道重塑模型中IL- 9的促纤维化作用可能与嗜酸性粒细胞有关[4]。可见，在不同的肺纤维化模型中IL- 9发挥完全不同的功能，可能是因为在肺部定位的不同或效应细胞的变化。

最近研究发现ETS基因家族中的PU.1是促进Th9细胞转录分化的重要因素[6]。目前已经发现PU.1有110多个直接靶基因[18]。PU.1的表达具有明显的组织特异性，表达水平的不同决定着多种免疫细胞的分化[19]。二氧化硅诱导的肺纤维化的发展主要位于炎性肺泡中的巨噬细胞[5]。顾兆伟等[20]研究过敏性鼻炎小鼠模型发现，小鼠鼻黏膜组织中IL- 9 mRNA表达水平与转录因子PU.1 mRNA表达水平呈正相关。本研究免疫组化检测显示，PU.1蛋白主要表达在巨噬细胞、淋巴细胞的细胞质和部分细胞核内，与以上诸多研究结果相符，与IL- 9的表达细胞种类相一致。相关性分析表明两者又呈正相关，提示在大鼠肺纤维化发生过程中，它们之间可能存在某种联系，也为以上理论提供了形态学依据。

PU.1 是Th9分化的特异性转录因子，在Th9细胞中PU.1直接与IL- 9基因启动子结合，促进IL- 9的分泌，如果上调PU.1的表达，IL- 9的分泌也明显增加；PU.1缺陷的小鼠IL- 9的表达极少[11]。PU.1绑定在IL- 9 基因位点上，通过促进IL- 9基因组蛋白乙酰化而促进Th9细胞的表达[21]。同时PU.1也是抑制Th2细胞分化的转录因子，PU.1通过限制GATA- 3和IRF4的功能影响Th2分化，同时抑制Th2细胞因子的产生，促使Th2向Th9细胞转化[11]。鲍文华等[7]研究发现随着炎症、纤维化进程的发展，肺纤维化组各时间点肺泡灌洗液中PU.1 mRNA含量明显高于对照组[8]。本研究结果显示，在纤维发生过程中，模型组和治疗组PU.1无论从转录水平还是从蛋白质水平的表达均逐渐增高且其明显高于对照组，与以上研究结果一致，提示PU.1可能在肺纤维化发生过程中起了促纤维化作用。肺组织免疫组化结果显示PU.1和IL- 9呈正相关且表达细胞类型一致，进一步提示高表达的PU.1可能通过促进IL- 9的分泌进而起到促进肺纤维化发生发展的作用。本研究发现第14天和21天时治疗组PU.1水平明显低于相应时间点的模型组，差异有统计学意义；而第28天时治疗组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。提示经活性维生素D3治疗后，在肺纤维化发生的早期阶段(即第14天和21天)PU.1的促纤维化作用被强烈抑制；而到后期(即第28天)此抑制作用减弱或消失，具体原因有待于进一步研究。

综上所述，活性维生素D3在大鼠肺纤维化发生发展的早期阶段具有一定的抑制作用，其机制可能是通过降低PU.1的表达水平，进一步减少IL- 9的分泌，从而对肺纤维化的发生发展发挥抑制作用，因此活性维生素D3有望成为肺纤维化的一种辅助治疗药物。

[1] 张宗梅,顾 盼,易祥华,等.骨化三醇对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响[J].中华结核和呼吸病杂志,2013,36(11):814- 820.

[2] 陈娴秋,刘瑞麟,李惠萍.1,25- (OH)2 D3治疗肺纤维化的动物实验研究[J].医学研究杂志,2012,41(12):129- 132.

[3] Soroosh P,Doherty TA.Th9 and allergic disease[J].Immunology,2009,127(4):450- 458.

[5] Arras M,Huaux F,Vink A,etal.Interleukin- 9 reduces lung fibrosis and type 2 immune polarization induced by silica particles in a murine model[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2001,24(4):368- 375.

[6] Chang HC,Sehra S,Goswami R,etal.The transcription factor PU.1 is required for the development of IL- 9- producing T cells and allergic inflammation[J].Nat Immunol,2010,11(6):527- 534.

[7] 鲍文华,王 瑾,李树民,等.Th9细胞相关因子在肺纤维化大鼠中的作用[J].中国呼吸与危重监护杂志,2016,15(3):227- 231.

[8] 杨晓东,周 颖,鲍文华,等.TH9在大鼠肺纤维化中的表达及其与TGF- β、HGF关系的研究[J].临床肺科杂志,2016,21(3):400- 403.

[9] Moeller A,Ask K,Warburton D,etal.The bleomycin animal model:a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?[J].Int J Biochem Cell Biol,2008,40(3):362- 382.

[10] Chen F,Wang PL,Fan XS,etal.Effect of Renshen Pingfei Decoction,a traditional Chinese prescription,on IPF induced by Bleomycin in rats and regulation of TGF- β1/Smad3[J].J Ethnopharmacol,2016,186(2):289- 297.

[11] Dardalhon V,Awasthi A,Kwon H,etal.IL- 4 inhibits TGF- beta- induced Foxp3+T cells and,together with TGF- beta,generates IL- 9+IL- 10+Foxp3(- ) effector T cells[J].Nat Immunol,2008,9(12):1347- 1355.

[12] Jiang S,Wang Z,Ouyang H,etal.Aberrant expression of cytokine interleukin 9 along with interleukin 4 and interferon γ in connective tissue disease- associated interstitial lung disease:association with severity of pulmonary fibrosis[J].Arch Med Sci,2016,12(1):101- 106.

[13] Evans CM,Kim K,Tuvim MJ,etal.Mucus hypersecretion in asthma:causes and effects[J].Curt Opin Pulm Med,2009,15(1):4- 11.

[14] Steenwinckel V,Louahed J,Orabona C,etal.IL- 13 mediates in vivo IL- 9 activities on lung epithelial cells but not on hematopoietic cells[J].J Immunol,2007,178(5):3244- 3251.

[15] McMillan SJ,Bishop B,Townsend MJ,etal.The absence of interleukin 9 does not affect the development of allergen- induced pulmonary inflammation nor airway hyperreactivity[J].J Exp Med,2002,195(1):51- 57.

[16] Reader JR,Hyde DM,Schelegle ES,etal.Interleukin- 9 induces mucous cell metaplasia independent of inflammation[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2003,28(6):664- 672.

[17] Arras M,Louahed J,Simoen V,etal.B lymphocytes are critical for lung fibrosis control and prostaglandin E2 regulation in IL- 9 transgenic mice[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2006,34(5):573- 580.

[18] 王 权,孙文逵.转录因子PU.1与机体免疫功能的相关性及其研究进展[J].医学研究生学报,2013,26(10):1096- 1100.

[19] Laslo P,Spooner CJ,Warmflash A,etal.Multilineage transcriptional priming and determination of alternate hematopoietic cell fates[J].Cell,2006,126(4):755- 766.

[20] 顾兆伟,赵 鹤,曹志伟.过敏性鼻炎小鼠鼻黏膜组织中白介素9及转录因子PU.1 表达水平的研究[J].中国全科医学,2016,19(12):1420- 1428.

[21] Goswami R,Kaplan MH.Gcn5 is required for PU.1- dependent IL- 9 induction in Th9 cells[J].J Immunol,2012,189(6):3026- 3033.

[收稿2016- 11- 29 修回2017- 01- 19]

(编辑 倪 鹏)

Impact of 1,25(OH)2VD3on expression levels of IL- 9 and PU.1 in rats with pulmonary fibrosis

ZHENG Jing,LIU Nai- Guo,NI Na,DONG Hong- Liang,WANG Nan,CHENG Miao- Qing.

Department of Clinical Medicine Laboratory,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603,China

Objective:To explore the function of IL- 9 and PU.1 on genesis and development of pulmonary fibrosis,and the effect of active vitamin D3[1,25(OH)2VD3] on the expression levels of this two factors during the pathogenesis of fibrosis.Methods: 90 male SD rats were randomly divided into model group,treatment group,control group (n=30).Bleomycin(5 mg/kg) was injected into the trachea of rats to establish the model of pulmonary fibrosis in the model group and treatment group,while the control group was injected with isopyknic sterile saline.The treatment group,the model group and the control group were injected intraperitoneally with active vitamin D3,solvent of vitamin D3(propylene glycol) and sterile saline on the 2nd day after surgery respectively.All injections were carried out once every other day.10 rats were euthanized at 14th,21st and 28th day in each group in turn.After obtaining lung tissues from experimental rats,the pathological change of lung was compared by hematoxylin- eosin staining.The difference of collagen fiber and hydroxyproline content were compared by the Masson staining and basic- hydrolysis method respectively.The mRNA and protein expression of IL- 9 and PU.1 in lung tissue were detected by Real- time PCR and immunohistochemical technology respectively.The expression of IL- 9 in serum was detected by ELISA.Results: Fibrosis appeared in lungs of experimental rats treated with bleomycin after 14 days,and more and more aggravated with time.At three time points,the hydroxyproline content in model group and treatment group were significantly higher than that of control group,and the treatment group was significantly lower than the model group.At three time points,the expression of IL- 9 and PU.1 in model group and treatment group were risen gradually,and obviously higher than that in control group.On the 14th and 21st day,the expression of two factors in treatment group was significantly lower than model group;on the 28th day,there was no statistically significant difference between treatment group and model group(P>0.05).In model group and treatment group,the expression of two factors on 21st day was significantly higher than that on 14th day;there was no statistically significant difference between the 28th day and the 21st day.Conclusion: IL- 9 and PU.1 may play a profibrotic role at early stage of pulmonary fibrosis induced by bleomycin.The active vitamin D3may lower the expression level of PU.1,and then reduce the secretion of IL- 9，thus may play an inhibiting effect on genesis and development of pulmonary fibrosis in rats.

Pulmonary fibrosis;Active vitamin D3;IL- 9;PU.1

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.003

①本文受山东省自然科学基金(ZR2011HM062)和山东省医药卫生科技发展计划项目(2015WS0490)资助。

郑 静(1981年-)，女，硕士，主管技师，主要从事分子免疫学方面的研究，E- mail：zhengjing2003@126.com。

及指导教师：刘乃国(1966年-)，男，博士，教授，主要从事分子免疫和细胞免疫学方面的研究，E- mail：liunaiguo1966@163.com。

R392.11

A

1000- 484X(2017)08- 1135- 06