HPLC法测定参萸清眩膏中马钱苷的含量

王秀琴，王东兴，徐春静，史志新，钱秋玉，陈 军（陆军总医院263临床部药剂科，北京 101149）

HPLC法测定参萸清眩膏中马钱苷的含量

王秀琴，王东兴，徐春静，史志新，钱秋玉，陈 军（陆军总医院263临床部药剂科，北京 101149）

目的：建立测定参萸清眩膏含量的方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（11 : 89）；检测波长：240 nm；柱温：30 ℃，流速：1.0 mL·min-1。结果：马钱苷与其它杂质峰分离良好。马钱苷在11.20 ～ 112.00 µg·mL-1范围内与色谱峰面积呈现良好的线性关系（r= 0.999 9，n= 7），平均回收率为99.9%，RSD = 1.75%（n= 9）。结论：本方法操作简便、准确、重复性好，可用于参萸清眩膏含量的测定。

高效液相色谱法；马钱苷；含量测定

参萸清眩膏由山茱萸、熟地黄、菟丝子、党参、枸杞子等九味中药组成的复方制剂，用于各种原因引起的眩晕的防治。该制剂原质量标准中无含量测定，只鉴别山茱萸、肉苁蓉、枸杞子，不足以控制制剂的质量，为提高该制剂的质量标准，本实验参考相关文献[1-4]，采用高效液相色谱法，测定制剂中君药山茱萸有效成分马钱苷的含量。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BT125D型电子天平（德国赛多利斯）；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；LDZ5-2型离心机（北京京立离心机有限公司）；CQ-800B型超声仪（深圳市科洁超声科技有限公司）；乙腈（色谱纯，国家集团化学试剂有限公司）。

马钱苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111640-201005，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时后使用，纯度：99.2%）；其它试剂均为分析纯。参萸清眩膏（本院自制，250 mL/瓶，批号：150309、150107、150520）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈-水（11∶89）；检测波长：240 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：5 µL；理论板数按照马钱苷峰计算应不低于3000。

2.2 溶液的制备

（1）对照品溶液：取马钱苷对照品约10 mg，精密称定置50 mL量瓶中加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密量取2 mL对照品储备液置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（10 ℃以下保存）。

（2）供试品溶液：取本品约2 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入80%甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上层清液，滤过，即得。

（3）阴性对照溶液：取不含山茱萸的参萸清眩膏阴性样品约2 g，同供试品溶液制备法制备。

2.3 系统适用性实验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5 µL，注入液相色谱议，按“2.1”项下色谱条件进行测定。实验表明：对照品主峰与供试品主峰保留时间一致，阴性样品无干扰，专属性良好，结果见图1。

2.4 线性关系考察

精密称取马钱苷对照品11.29 mg，置于50 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。再分别精密量取储备液0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、 3.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，用80%甲醇定容，摇匀，即得系列浓度对照品溶液。分别精密吸取系列浓度对照品溶液各5 µL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：Y= 8.420 7X+ 0.859 2，r= 0.999 9。结果表明马钱苷进样量在11.20 ～ 112.00 µg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图1 HPLC色谱图A – 对照品溶液，B – 供试品溶液，C – 阴性对照溶液，D – 溶剂；1 –马钱苷Fig 1 HPLC chromatogramsA – reference substance, B – sample, C – negative reference substance, D – solvent; 1 – loganin

2.5 精密度实验

精密吸取马钱苷对照品溶液5 µL，注入液相色谱议，按“2.1”项下色谱条件进行测定，连续重复进样6次，记录色谱图，计算马钱苷峰面积的RSD为0.40%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一批样品（批号150309）6份，按“2.2”项下方法制备，依法测定。结果表明，参萸清眩膏中马钱苷含量平均值为0.300 6 mg·g-1（RSD = 0.88%，n= 6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取同一批样品（批号150309）制备的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h测定，马钱苷峰面积RSD为1.54%，表明供试品溶液在12 h内稳定。马钱苷峰面积的RSD为1.54%（n= 7），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.8 回收率实验

精密称取马钱苷对照品13.76 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加样用马钱苷溶液。分别取0.8、1.0、1.2 mL加样用马钱苷溶液，按低（80%）、中（100%）、高（120%）三个剂量组，置于25 mL量瓶中再分别精密称取同一批已知含量的样品（批号150309）9份，每份约1.0 g，加入80%甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上层清液，滤过，依法测定，计算得马钱苷的平均回收率为99.91%，RSD为1.75%。见表1。

表1 马钱苷加样回收率实验结果.n= 9Tab 1 Results of recovery test for loganin.n= 9

2.9 样品含量测定

取不同的3批样品（批号150309、150107、150520），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行含量测定，测定数据与结果详见表2。

2.1 0 方法耐用性实验

取本品（批号150309）按“2.1”项下方法制备供试品溶液，使用不同品牌的色谱柱，色谱条件不变，测定马钱苷的含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 参萸清眩膏指标成分及含量测定方法的选择

参萸清眩膏由山茱萸、熟地黄、菟丝子、党参、枸杞子等九味中药组成的复方制剂，山茱萸性味酸、涩、微温，归肝、肾经，具有补益肝肾、涩精固脱功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精等。参萸清眩膏为非标制剂，组成成分复杂，含量指标选择较难确定，该制剂原质量标准中未对其进行含量测定。根据《中国药典》、参考相关文献及专家审批建议[1-6]，选定处方组成中的君药山茱萸的有效成分马钱苷作为指标成分，采用HPLC法对其进行含量测定，经方法学验证，该法操作简便、专属性强、结果准确，适用于该制剂的质量控制。

表2 马钱苷含量测定结果.n= 3Tab 2 Contents determination of loganin.n= 3

表3 不同类型色谱柱测得马钱苷含量.n= 3表3 Contents determination of loganin by different types of columns.n= 3

3.2 参萸清眩膏含量限度的确定

本制剂为中药制剂，进行含量限度测定须注意是在保证药物成分对临床安全和疗效稳定的情况下，并具有足够的代表性的样品实验数据为基础，结合药材含量及工艺回收率综合分析制定。本研究所测成分的原料为粉末、提取物入药，该成分的转移率应不低于85%，且所测成分的原料在制备工艺中经溶剂提取时，该成分转移率一般应不低于30%。

3.3 HPLC法测定条件的优化

3.3.1 检测波长选择参考文献[3,6]并采用二级管阵列检测器（DAD）进行全波长扫描显示，马钱苷在240 nm波长范围处有最大吸收，峰形良好且不受杂质峰和溶剂峰的干扰，因此选择240 nm作为检测波长。

3.3.2 流动相的选择本研究选用了乙腈-水作为流动相[7-8]，经过多次实验确定了以乙腈-水（11 : 89）比例为马钱苷含量测定的流动相，峰形好、分离度和保留时间合理，基线平稳，灵敏度高，重现性和回收率好，完全能满足该品种质量标准的要求，理论塔板数达9000以上，能作为参萸清眩膏的质量控制方法。

3.3.3 色谱柱的选择参考文献[9-11]并根据三种类型的色谱柱[Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 µm）、Waters Bridge C18柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）、Thermo Hypersil GOLD C18柱（4.6 mm×150mm，5 µm）]的实验结果，最终选择以马钱苷含量较高，指标成分峰形和分离度好的Agilent ZORBAX SBC18柱（150 mm×4.6 mm，5 µm）作为色谱柱，建立的含量测定方法快速、简捷、准确度高，基质对测定无干扰、分离效果好，可用于参萸清眩膏中马钱苷的含量测定。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：26.

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Content determination of loganin inShenyuqingxuanelectuary by HPLC

WANG Xiu-qin, WANG Dong-xing, XU Chun-jing, SHI Zhi-xin, QIAN Qiu-yu, CHEN Jun(Pharmacy of 263 Clinical Department of the Army General Hospital, Beijing 101149, China)

Objective:To establish the HPLC method for determining the content ofShenyuqingxuanelectuary.Methods:HPLC analysis was carried out with Agilent ZORBAX SB-C18column (4.6 mm × 150 mm, 5 μm), the mobile phase consisted of acetonitrile-water (11 : 89), the detection wavelength was 240 nm, the column temperature was 30 ℃and the fl ow rate was 1.0 mL·min-1.Results:The samples were separated well from impurities by HPLC method. Loganin was linear in the range of 11.20 – 112.00 µg·mL-1(r= 0.999 9,n= 7). The average recovery and RSD of loganin were 99.9% and 1.75% (n= 9).Conclusion:This method is simple, accurate and repeatability, which can be applied as the quantitative method for the determination of loganin inShenyuqingxuanelectuary.

HPLC; Loganin; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)04 – 0211 – 04

2017-02-27

2017-05-04）

军队十二五面上项目，军队医疗机构制剂质量标准计划（14ZJZ06-1）

钱秋玉，女，主管药师，研究方向：药品分析与药品质量控制。E-mail：568175262@qq.com

王秀琴，女，副主任药师，主要从事药事管理及临床药学工作。E-mail：wangxq69@163.com