CD133基因启动子的克隆与序列分析

王晓峰，张天夫，刘 新，刘晓军

(1.吉林大学中日联谊医院 口腔科,吉林 长春130033；2.吉林大学中日联谊医院 妇产科)

CD133基因启动子的克隆与序列分析

王晓峰1，张天夫1，刘 新1，刘晓军2*

(1.吉林大学中日联谊医院 口腔科,吉林 长春130033；2.吉林大学中日联谊医院 妇产科)

近些年来，口腔颌面部恶性肿瘤的发病率逐年增加[1]。虽然目前针对恶性肿瘤的治疗手段有了很多新的进展,但仍有部分肿瘤患者不能治愈。自从肿瘤干细胞(CSCs)理论提出后，给肿瘤患者带来了新的曙光[2]。有研究表明，CD133是某些头颈部肿瘤干细胞的表面特异性标记[3，4]，我们推测CD133+细胞可能是头颈部肿瘤的干细胞。所以我们克隆了CD133基因的启动子并对其进行序列分析，为进一步探究CD133基因与肿瘤干细胞之间的关系提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DH5α菌株和质粒，来源于吉林大学中日联谊医院科研中心。DNA Marker及限制性内切酶SpeI、MluI(日本Takara 公司)。限制性内切酶PacⅠ，SalⅠ(英国NEB公司)。Trans2K Plus DNA Marker(上海宝曼生物技术公司)。Blood gDNA Miniprep Kit(美国Biomiga公司)。引物合成(上海生工技术有限公司)。

1.2 人CD133基因启动子的克隆

1.2.1 DNA提取及PCR引物设计 按试剂盒说明书进行外周血细胞基因组DNA的提取，并电泳鉴定。从Genbank数据库获得人CD133基因启动子的DNA序列，PCR产物的长度为1 810 bp。设计引物如下：

上游引物： 5’-GTAGTCGACCTTCAGTGCCTCTTTCAGT-3’；下游引物5’-GCCTTAATTAAGTGGGGATCTGCCTCAGTC-3’。

1.2.2 PCR反应 以人外周血基因组DNA为模板进行PCR反应，反应产物经电泳鉴定。进行PCR产物的回收，产物电泳鉴定后于-20℃保存。

1.2.3 DH5α感受态细菌的制备及CD133基因启动子PCR产物TA克隆 制备DH5α感受态细菌， -80℃保存。进行CD133基因启动子PCR产物的T-A连接，16℃，30 min。

1.2.4 重组质粒的提取 将TA连接产物进行转化，进行重组质粒的提取，电泳鉴定。

1.2.5 重组质粒的酶切鉴定 对提取的重组质粒pMD18-pCD133进行酶切，电泳鉴定。

1.2.6 重组质粒测序鉴定 将酶切鉴定的重组质粒进行扩增，进行DNA测序。

2 结果

2.1 人CD133基因启动子克隆的PCR结果

PCR产物经电泳检测，可看到一清晰的扩增带出现在1 810 bp附近，符合设计的人CD133基因启动子的长度，电泳结果见图1。

1：人CD133基因启动子PCR产物; M：DNA marker D2000

2.2 酶切鉴定重组质粒pMD18-CD133的结果

应用限制性内切酶PacⅠ和SalⅠ-HF双酶切质粒pMD18-CD133，酶切产物经电泳鉴定，在1 810 bp附近出现与CD133启动子片段长度相符的电泳带，酶切结果见图2。

2.3 CD133的测序结果

应用Blast软件进行测序，结果见图3。

1：重组质粒pMD18-pCD133 ；M：DNA marker 2000;2：pMD18-pCD133经PacⅠ和SalⅠ-HF双酶切

图2 酶切鉴定pMD18-pCD133琼脂糖凝胶电泳图谱

3 讨论

现阶段针对口腔颌面部恶性肿瘤的治疗手段越来越多，但治疗效果仍然不理想,复发率和转移率依然很高。肿瘤干细胞理论的报道[2]给我们带来曙光。寻找肿瘤细胞表面特异性标记物,通过筛选肿瘤干细胞,将会为进一步研究肿瘤发生、发展和预后带来新的希望。目前研究表明,CD133 可能是很多肿瘤干细胞的表面标志。因此我们进行了CD133基因启动子的克隆及序列分析，为进一步探究CD133基因的调控机制提供新的理论依据。

图3 重组克隆质粒pMD18-T-CD133测序图

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al. Global cancer statistics,2002[J]. CA Cancer J Clin,2005,55(2):74.

[2]Mackillop WJ，Ciampi A，Till JE，et al．A stem cellmodel of human tumor growth， implications for tumor cell clonogenicassays[J]．Journal of the national cancer institute，1983，70:9．

[3]Zhou L,Wei X,Cheng L,et al. CD133,one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line[J].Laryngoscope,2007,117(3):455.

[4]Moon Y,Kim D,Sohn H,et al.Effect of CD133 overexpression on the epithelial-to-mesenchymal transition in oral cancer cell lines[J].Clin Exp Metastasis,2016,33(5):487.

吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(JJKH20170822KJ) 吉林省直卫生专项项目(sczsy201525)

1007-4287(2017)08-1428-02

2017-04-21)

*通讯作者