丹红提取物对脊髓型颈椎病的治疗机制初探

杨家祥，杨环玮，董军格，于健，胡亚南，梁君，唐艳阁

（1.河北省中医院骨伤一科，石家庄 050000；2.河北省秦皇岛市中医医院呼吸科，河北 秦皇岛 066000；3.河北省中医院骨伤二科，石家庄 050000；4.河北省保定市儿童医院外科，河北 保定 071000；5.河北省石家庄市平山县大吾乡卫生院，石家庄 050408；6.河北省中医院内分泌科，石家庄 050000）

丹红提取物对脊髓型颈椎病的治疗机制初探

杨家祥1，杨环玮2，董军格1，于健3，胡亚南4，梁君5，唐艳阁6

（1.河北省中医院骨伤一科，石家庄 050000；2.河北省秦皇岛市中医医院呼吸科，河北 秦皇岛 066000；3.河北省中医院骨伤二科，石家庄 050000；4.河北省保定市儿童医院外科，河北 保定 071000；5.河北省石家庄市平山县大吾乡卫生院，石家庄 050408；6.河北省中医院内分泌科，石家庄 050000）

目的探讨丹红提取物对大鼠脊髓型颈椎病动物模型的治疗作用机制。方法取SD大鼠30只，建立大鼠脊髓型颈椎病动物模型，将大鼠分为正常对照组、模型组和实验组。实验组每天给予丹红提取物，正常对照组和模型组给予等体积的生理盐水。于给药前及给药4周后进行改进Rivlin斜板实验，检测大鼠的运动功能。给药4周后处死大鼠，检测椎间盘组织中白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和bcl-2的表达情况。结果斜板实验表明，给药4周后实验组斜板度数有所增加，且大于模型组。处死大鼠后发现模型组细胞因子的表达量高于实验组，bcl-2的表达量低于实验组。结论丹红提取物可以缓解脊髓型颈椎病。

丹红提取物；脊髓型颈椎病；炎症；凋亡

脊髓型颈椎病通常表现为肢体麻木、无力或者行走障碍，这些症状对患者的生活及工作有严重影响，对患者健康威胁极大［1］。脊髓受压迫的主要病理变化可以表现为颈椎间盘退变突出或增生性骨刺［2-3］。中医药在脊髓型颈椎病的治疗中有其独特优势，这些优势主要表现为选择多样、适应证广泛、不良反应少和经济简便等［4-6］。

丹红提取物具有活血化瘀和通脉舒络等作用，目前已有研究［7］指出，丹红提取物可对脊髓型颈椎病的患者有一定治疗作用，但是具体机制并未见详细报道。

本研究构建大鼠脊髓型颈椎病模型，观察丹红提取物对大鼠的行动状态、炎性细胞因子和凋亡相关蛋白的影响，探讨丹红提取物缓解脊髓型颈椎病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠30只，体质量（200±20）g，8～10周龄，雌雄各半（雌雄均分开喂养），购自河北省中医院实验动物中心。

1.1.2 实验药品：丹红提取物由中国药科大学提供。重组人骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）购自上海麦仓生物技术有限公司。ELISA检测试剂盒购自上海丽臣商贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型构建：将实验动物分为3组，对照组、模型组和实验组（中药治疗组），每组各10只。除正常对照组外，其余大鼠均在颈椎间盘后缘植入BMP与载体的复合制剂，以使椎间盘组织退变、骨化，并对颈段脊髓造成慢性压迫，制成理想的脊髓型颈椎病动物模型［8］。用10%水合氯醛（300 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，碘伏消毒，于颈前正中偏右做纵行切口，长约2～3 cm，显露椎体前方及椎间隙。在X线引导下，确认颈C4～5椎间隙，向椎间隙注入BMP 0.1 mL后缝合。于造模成功后第2天开始给药，实验组以5.6 mL/（kg·d）的剂量给予丹红提取物［9］，对照组和模型组给予等体积的生理盐水，共给药4周。

1.2.2 改进Rivlin斜板试验：将大鼠以正、反2个方向置于可调节橡胶面斜板上，分别测定其在斜板上停留10 s的最大倾斜角度，2个方向的角度取平均值得到该动物斜板试验的功能角度。每只大鼠测3次，取平均值。

1.2.3 ELISA：将取出的椎间盘组织冲洗干净，用滤纸吸干水分，称重后剪碎，每100 mg组织加入1 mL PBS稀释，匀浆后离心取上清液。按照试剂盒说明书进行实验操作，最后于450 nm处测定吸光度后计算结果。

1.2.4 Western blotting：将取出的椎间盘组织冲洗干净，用滤纸吸干水分，称重后剪碎，每100 mg组织加入1 mL RIPA裂解提取蛋白。提取蛋白后，每个样本取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳、电泳结束后100 V转膜1 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗（1∶200）4℃过夜，二抗（1∶1 000）室温1 h。白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、bcl-2和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体以及相关二抗均购自SANTA公司。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，差异性检验使用非配对t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹红提取物对脊髓型颈椎病大鼠运动功能的影响

构建大鼠脊髓型颈椎病模型后，对照组、模型组和实验组大鼠分别进行改进Rivlin斜板实验，通过斜板度数对大鼠的运动功能进行评估。结果发现，术后模型组和实验组大鼠的斜板度数均显著低于对照组，说明实验模型构建成功。丹红提取物治疗4周后的大鼠斜板度数明显高于模型组，说明丹红提取物可以缓解脊髓型颈椎病导致的大鼠运动功能障碍，见表1。

表1 大鼠给药前后Rivlin斜板度数Tab.1 Rivlin oblique plate number degree of rats before and af⁃ter administration

表1 大鼠给药前后Rivlin斜板度数Tab.1 Rivlin oblique plate number degree of rats before and af⁃ter administration

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Group n Before After 4 weeks Control 10 56.98±2.17 58.12±2.01 Model 10 35.54±1.141） 32.22±0.781）Experiment 10 36.02±1.211），2） 50.57±2.311），2）

2.2 丹红提取物对脊髓型颈椎病大鼠炎性细胞因子表达的影响

模型组和实验组大鼠的IL-6和TNF-α表达均高于对照组大鼠（P＜0.05），实验组大鼠经丹红提取物治疗4周后IL-6和TNF-α表达明显低于模型组（P＜0.05）。说明丹红提取物可以降低脊髓型颈椎病大鼠模型炎性细胞因子的释放，在一定程度上缓解脊髓型颈椎病，见表2，图1。

表2 3组大鼠椎间盘组织中IL⁃6和TNF⁃α的含量Tab.2 The expression of IL⁃6 and TNF⁃α in the intervertebral disc of different groups

表2 3组大鼠椎间盘组织中IL⁃6和TNF⁃α的含量Tab.2 The expression of IL⁃6 and TNF⁃α in the intervertebral disc of different groups

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Group n IL-6 TNF-α Control 10 0.56±0.04 0.73±0.07 Model 10 1.31±0.131） 1.44±0.241）Experiment 10 0.94±0.091），2） 0.87±0.111），2）

2.3 丹红提取物对脊髓型颈椎病大鼠凋亡相关蛋白表达的影响

图1 3组大鼠椎间盘组织中IL⁃6和TNF⁃α的表达情况Fig.1 The expression of IL⁃6 and TNF⁃α in the intervertebral disc of different groups

模型组和实验组大鼠的bcl-2表达均低于对照组大鼠（P＜0.05），实验组大鼠经丹红提取物治疗4周后bcl-2的表达明显高于模型组（P＜0.05）。说明丹红提取物可以减少脊髓型颈椎病大鼠模型凋亡蛋白bcl-2的表达，见表3，图2。

表3 3组大鼠椎间盘组织中bcl⁃2含量Tab.3 The expression of bcl⁃2 in the intervertebral disc of differ⁃ent groups

表3 3组大鼠椎间盘组织中bcl⁃2含量Tab.3 The expression of bcl⁃2 in the intervertebral disc of differ⁃ent groups

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

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图2 3组大鼠椎间盘组织中bcl⁃2的表达情况Fig.2 The expression of bcl⁃2 in the intervertebral disc of differ⁃ent groups

3 讨论

中医药治疗脊髓型颈椎病的手段有很多，主要有中药内服外敷、针刺、牵引、穴位注射、艾灸和联合应用多种治疗手段的综合疗法等。其中中药内服外敷是最主要的治疗方式。詹运开［10］通过对40例脊髓型颈椎病患者采用活络效灵汤内服治疗后的效果进行观察，发现药物治疗有效率为87.6%，证明中药活络效灵汤对于脊髓型颈椎病有很好的治疗效果。很多研究证实，中药可以改善脊髓型颈椎病患者的血液循环，消除炎症，减少神经细胞坏死及凋亡，调节酶活性，清除自由基损害，减少NO生成，提高神经营养因子含量。

脊髓型颈椎病可以导致运动功能的障碍［11-12］，大鼠的改良Rivlin斜板实验结果显示，大鼠脊髓型颈椎病模型构建成功后模型组大鼠的斜板度数明显降低，经丹红提取物治疗4周后斜板度数升高明显，与模型组对照差异显著（P＜0.05），这说明丹红提取物对脊髓型颈椎病大鼠的运动功能的恢复可有一定作用。

IL-6和TNF-α均是炎性细胞因子，广泛参与了人体组织破坏、水肿形成等多个过程，可以促进炎症反应中的白细胞附壁、血管通透性增加、渗出等过程。脊髓型颈椎病中椎间盘组织中的IL-6和TNF-α可引起炎症细胞的聚集，加速颈椎间盘的退变［13］。本研究在脊髓型颈椎病造模后的模型大鼠椎间盘中检测出的IL-6和TNF-α含量均高于正常大鼠，印证了脊髓型颈椎病可以促进炎性细胞因子的释放，经过治疗后的实验组大鼠椎间盘中的IL-6和TNF-α表达含量有所下降，这说明丹红提取物可以通过降低炎性细胞因子的释放来对脊髓型颈椎病起到治疗作用。

近年来各种研究［14-15］表明脊髓在缺血损伤以及创伤后均可发生一定程度的细胞凋亡现象，脊髓型颈椎病可以导致细胞凋亡的产生。有研究者在脊髓型颈椎病大鼠模型中通过TUNEL标记法及免疫组化染色发现大鼠体内有大量胶质细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2的表达下调［15］。本研究发现模型构建成功后大鼠椎间盘内的bcl-2表达明显下调，在丹红提取物治疗后bcl-2的表达有所上升，说明凋亡情况得到了缓解，从另一个角度说明丹红提取物可以缓解脊髓型颈椎病。

本研究表明，丹红提取物可以在一定程度上缓解脊髓型颈椎病，为临床上脊髓型颈椎病的治疗提供了更多的选择与理论基础。

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（编辑 于 溪）

Mechanism of Dan Hong Treatment of Cervical Spondylotic Myelopathy

YANG Jiaxiang1，YANG Huanwei2，DONG Junge1，YU Jian3，HU Yanan4，LIANG Jun5，TANG Yange6

（1.Department of Orthopaedics，Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050000，China；2.Department of Respiration，Qinhuangdao City Chinese Medicine Hospital，Qinhuangdao 066000，China；3.Department of Orthopaedics of Hebei Provincial Hospital，Shijiazhuang 050000，China；4.Department of Surgery，Baoding City Children’s Hospital，Baoding 071000，China；5.Dawu Health Center，Pingshan Country，Shijiazhuang 050408，China；6.Department of Endocrinology，Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo investigate the therapeutic mechanism of Dan Hong in a rat model of cervical spondylotic myelopathy（CSM）.Meth⁃odsThirty Sprague-Dawley rats were divided into an experimental group（n=10），a CSM model group（n=10），and a control group（n=10）. The CSM model group

a Dan Hong injection，while the control and experimental groups received an injection of an equivalent volume of physiological saline.The motor function of the rats was assessed before administration and at 4 weeks after administration，at which time the rats were sacrificed.The expression of cytokines and bcl-2 was detected by ELISA and Western blotting.ResultsFour weeks after treatment，the number of oblique plates in the experimental group increased.Additionally，the expression of cytokines（IL-6 and TNF-α）in the CSM model group was higher and the expression of bcl-2 was lower.ConclusionDan Hong injection can reduce the inflammatory response and reduce cell apoptosis in CSM.

Dan Hong；cervical spondylotic myelopathy；inflammation；apoptosis

R681

A

0258-4646（2017）08-0710-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.009

河北省中医药管理局科研计划（2016030）

杨家祥（1982-），男，主治医师，硕士.

唐艳阁，E-mail：148059182@qq.com

2017-01-12

网络出版时间：