烟雾刺激通过损伤A549细胞DNA诱导细胞凋亡发生

谭小田 张志敏 赵琳

·短篇论著·

烟雾刺激通过损伤A549细胞DNA诱导细胞凋亡发生

谭小田1张志敏2赵琳3

细胞凋亡； 烟雾损伤； 白细胞介素-1β； 肿瘤坏死因子-α

呼吸道烟雾吸入性损伤是一种极其常见的损伤，常发生于火灾、毒气泄漏或是吸烟等情况下[1]。烟雾吸入性损伤常常由于吸入燃烧产生的高温、有毒气体而导致，轻者可以出现呼吸道的不适反应，重者则会影响呼吸道的通畅，导致患者窒息死亡。呼吸道烟雾吸入性损伤主要分为两个方面：首先，高温气体的吸入可以引起呼吸道的灼伤，导致呼吸道黏膜损伤，出现渗出及水肿，严重的可以出现呼吸困难，如果治疗不当，后期还会出现气管狭窄等并发症；其次，烟雾中有毒有害气体的吸入也会引起呼吸道的损伤以及烟雾吸入性急性呼吸窘迫综合征[2-3]。这些损伤给患者的救治带来了极大的困难，因此深入研究烟雾吸入导致呼吸道细胞损伤的机制，探索有效的救治方案至关重要。A549细胞是人来源的肺泡上皮细胞系，在受到烟雾刺激时，会出现皱缩、凋亡、坏死等现象，进而影响肺的血气屏障发挥正常的生理功能，导致肺部炎症、水肿的产生[4-5]。而DNA损伤是导致细胞生理功能障碍、细胞周期紊乱以及凋亡产生的重要原因之一[6]。DNA损伤是一种明确的细胞内部的凋亡信号，研究表明其主要通过激活依赖线粒体的凋亡信号通路实现的[7]。在烟雾吸入性肺损伤中，烟雾是否可以通过损伤肺泡上皮细胞的DNA，从而诱导细胞凋亡的发生仍不明确[8]。本研究旨在通过实验明确DNA损伤在烟雾吸入性肺部损伤发生发展中所起到的作用。

材料与方法

一、实验材料

A549细胞(ATCC，美国)，抗γ-H2A.X(phosphor S139)单克隆抗体(Abcam，美国)，抗GAPDH多克隆抗体(CST，美国)，CometAssay Silver检测试剂盒(TREVIGEN，美国)， IL-1β、TNF-α 酶联免疫检测试剂盒(Abcam，美国)。实验用到的香烟烟雾提取物是将香烟连接气体抽吸装置，将香烟点燃后，吸入的烟雾经由出口通入无血清的RIPM1640培养液中制备成悬液，然后用1 mol/L的NaOH调节pH值至7.4。最后经微孔滤膜过滤后使用。

二、实验方法

实验分为对照组、烟雾12 h组、烟雾24 h组、烟雾48 h组和阳性对照组。

1. 各组细胞的处理： 实验组取对数生长期的A549细胞，给予香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激预定时间(12、24和48 h)；对照组为正常条件下培养的A549细胞；阳性对照组取对数生长期的A549细胞，给予100 μM浓度的H2O2刺激20 min。用CCK-8法检测各组细胞的细胞活性改变。

2. ELISA检测： 各组细胞培养上清液中白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的含量：各组细胞按规定的处理完毕后，将细胞上清液小心吸出，在4 ℃，以离心半径8 cm，3 000 r/min离心5 min，取上清液，参照试剂盒的说明书进行检测。

3. 彗星实验： 彗星实验是一种检测细胞DNA损伤的有效方法。取对照组、烟雾刺激48 h和阳性对照组细胞，胰酶消化后离心收集细胞，PBS漂洗备用。首先将收集到的细胞与预先融化的LMAgarose混合，然后平铺在载玻片上。待其冷却凝固后，依次将其浸没在裂解液和解螺旋液中。然后21V恒压电泳30 min。最后采用DAPI标记DNA后荧光纤维镜下观察。具体实验步骤参照CometAssay Silver检测试剂盒说明书。

4. Western-blot检测： γ-H2A.X磷酸化情况：γ-H2A.X蛋白大量磷酸化是细胞DNA损伤时的重要的标志之一[9]。本实验采用Western-blot的方法检测其磷酸化情况的改变。取对照组、烟雾刺激48 h和阳性对照组细胞，用细胞刮刮下后，加入适量的蛋白裂解液于冰上裂解30 min，离心收集上清，加入蛋白上样缓冲液后沸水煮10 min，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转的方式将电泳后的聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白分子转移到PVDF膜上。待10%脱脂牛奶室温封闭1 h后，加入抗γ-H2A.X(phosphor S139)单克隆抗体(1︰1 000稀释)，4 ℃摇床震荡过夜。TBST洗膜后加入山羊抗兔的二抗，室温孵育2 h，再次TBST洗涤后显色、照相并进行扫描分析。

三、统计学方法

结 果

一、A549细胞活性的改变

烟雾提取物刺激A549细胞后，细胞活性较正常组显著降低(P<0.05)，并且呈现时间依赖性，刺激48 h细胞活性最低，仅为正常组的1/4，改变最为明显，见图1。

图1 A549细胞活性的改变；注：*P<0.05vs. 正常组

二、烟雾提取物对于A549细胞释放IL-1β和TNF-α的影响

烟雾提取物的刺激24 h和48 h可以引起IL-1β和TNF-α释放的增加，细胞培养上清液中的IL-1β和TNF-α水平均明显增高(P<0.05)，其浓度变化随刺激时间的延长而增加，以烟雾提取物刺激48 h变化最为显著，见图2。

图2 A549细胞培养上清液IL-1β和TNF-α检测结果；注：*P<0.05vs. 正常组

三、烟雾提取物对于A549细胞DNA双链完整性的影响

为检测烟雾提取物对于A549细胞DNA双链完整性的影响，进行了彗星实验。在单细胞电泳时受损DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形，DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大[10]。烟雾提取物刺激组细胞DNA呈明显的彗星样改变，而正常组细胞DNA呈球形，提示烟雾提取物的刺激可以引起A549细胞DNA双链结构的损伤，见图3。

图3 烟雾提取物对A549细胞DNA双链结构的影响

四、Western-blot检测γ-H2A.X磷酸化情况

γ-H2A.X蛋白大量磷酸化是细胞DNA损伤时的重要的标志之一[11]。本实验检测了其磷酸化水平的变化。烟雾提取物刺激组的γ-H2A.X磷酸化程度明显高于对照组，从另一方面证实了烟雾提取物的刺激具有DNA毒性，可以破坏DNA的完整性，见图4。

图4 γ-H2A.X磷酸化改变；注：*P<0.05vs. 正常组

讨 论

实验已经证实烟雾可以对肺脏产生明显的损伤作用，引起肺损伤及急性呼吸窘迫综合征。现阶段对于有毒气体吸入性损伤的研究主要为火灾导致的严重的烧伤以及一些常见建筑材料燃烧释放的有毒气体吸入引起的呼吸道及肺急性损伤。常见的表现为呼吸道的灼伤、呼吸道黏膜水肿、气管狭窄以及急性呼吸窘迫综合征[2, 12]。临床的治疗以消炎、预防感染、保持呼吸道通畅以及抗休克等一般维持治疗为主，并没有针对性的有效治疗药物或治疗方案[1]。烧伤早期治疗的一个重要组成部分就是维持呼吸道的通畅和治疗吸入性损伤[3]。吸入燃烧产生的具有毒性的气体所引起的死亡占到了火灾相关死亡中的很大一部分。产生的这些种类繁多的化合物可以通过协同作用，增加患者的病死率。近期研究表明20%～30%以上的严重烧伤都合并有烟雾吸入性损伤，如果不能得到有效治疗，其中20%～50%的患者将因此而丧命[13]。烟雾吸入性损伤主要包括五种常见的临床表现：急性上呼吸道阻塞、支气管痉挛、小气道阻塞、肺部感染和呼吸衰竭[14-15]。上呼吸道的损伤主要是继发于烟雾直接的热损伤和化学刺激；而下呼吸道损伤主要是由于有毒气体向远端的弥散以及全身或局部炎症反应的激活[2]。

对于烟雾引起肺脏损伤的原因及机制的研究依然不足。通过本实验证实香烟烟雾提取物可以对A549细胞产生损伤作用，引起细胞DNA双链结构的破坏。DNA受损是诱导细胞凋亡的重要信号之一，DNA损伤可以引起细胞核内蛋白分子与损伤处DNA的结合，并引发一系列信号级联反应以及细胞凋亡与凋亡执行相关分子的活动。DNA损伤诱导细胞凋亡绝大部分是通过依赖线粒体的信号通路来实现的。

烟雾提取物如何引起A549细胞DNA损伤方面的研究依然缺乏，需要进一步实验的研究。推测其与烟雾刺激下细胞线粒体功能的紊乱有密切的关系。有研究显示烟雾刺激可以导致A549细胞线粒体功能紊乱，膜电位降低，线粒体中的细胞色素C大量的释放到细胞质中，引起细胞凋亡的发生。除此之外细胞中的死亡受体通路也会被异常激活，共同促进细胞凋亡的发生[16]。线粒体功能的紊乱除了可以引起凋亡通路的激活以外，还会导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量产生，而ROS是一类已经被明确证实具有强烈的致DNA损伤的物质。因此我们推测烟雾提取物引起DNA损伤是通过线粒体-ROS途径产生作用的。

综上所述，本实验通过研究香烟烟雾提取物对于A549细胞的损伤作用，重点探索了A549细胞DNA双链结构的完整性，证实了烟雾提取物可以引起A549细胞DNA双链结构的破坏。

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(本文编辑：黄红稷)

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10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.04.021

710054 西安，解放军第四五一医院1710000 西安，唐都医院2721004 宝鸡，解放军第三医院3

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2016-10-20)